微流控集成核酸检测（MINT）：通过FEN1辅助的RPA与蜡基纯化及磁珠载体耦合实现

《Talanta》：Microfluidic integrated nucleic acid test (MINT) enabled by coupling FEN1-aided RPA with wax-purification and bead-carrier

　　

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  一种名为MINT的便携平台可在40分钟内实现从样本到结果的全流程检测。
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  混合蜡相在室温下保持固态，便于稳定储存，加热后液化，便于清洗。
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  可直接将结合DNA的微珠转移至FARPA系统中，简化操作流程。
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  MINT平台可检测临床尿液中的blaKPC-2，检测限为200 CFU/mL。

引言

近年来，即时检测（POCT）技术在紧急和重症监护应用中发挥着重要作用，用于快速鉴定病原体，尤其是抗微生物耐药菌。理想的病原体检测POCT应具备便携的体积，同时保持与传统实验室方案相似的高分析性能，后者可能需要使用各种仪器进行样本制备和目标识别[1]、[2]、[3]。要具有临床可行性，POCT系统应易于操作，并能够在不进行任何手动样本处理的情况下快速呈现结果。

实现病原体即时检测（POCT）"从样本到结果"的关键在于将DNA提取与DNA扩增及扩增产物识别自动衔接[4]、[5]。目前，各种固相核酸提取方法已被开发出来，包括磁珠和玻璃纤维膜等[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。然而，这些方法与扩增方案（如PCR、LAMP[11]或RPA[12]方法）的自动耦合十分困难，因为提取DNA所需的繁琐步骤阻止了真正集成系统的实现；例如，大多数DNA提取方法都需要无水乙醇洗涤步骤，随后用水洗脱步骤，该步骤使用了大量液体。同时，乙醇的使用可能使残留物严重抑制后续的核酸扩增反应，需要打开管盖以完全蒸发[6]、[13]，限制了POCT系统"从样本到结果"的简单设计。

为避免使用乙醇，提出了以油相或液态蜡作为洗涤介质，并开发了油/蜡基POCT芯片与磁珠DNA提取的耦合方案[14]、[15]、[16]。然而，油或蜡引起的液-液界面张力给芯片的储存和运输带来了问题。这产生了对开发替代样本制备方法的明确需求，因此提出了一种基于某种蜡的方法，该蜡在环境条件下为固态，但在高温下变为液态。反应试剂与DNA提取试剂通过固态蜡良好密封在芯片中。

除了样本制备外，核酸扩增方法应与集成POCT系统高度兼容。由于不需要严格步骤，等温扩增技术比PCR更适合建立简单的POCT，这些方法包括NEAA[17]、LAMP和RPA。核酸扩增无需依赖热循环仪即可完成，因此促进了设备小型化，特别适用于现场快速检测。在这些DNA扩增方法中，RPA对POCT尤为适用，因为室温即可快速运行灵敏的RPA，相比热循环仪大幅简化了仪器配置[8]、[15]、[18]。

然而，在一管法格式中特异性检测RPA扩增产物十分困难。目前已有一些策略来解决这一问题，例如将关键组分（Mg²⁺）附着在RPA直接完成后管盖顶部进行离心，或通过打开管盖将检测试剂（Cas 12a）加入RPA扩增产物中。这些方法对POCT而言过于繁琐，我们开发了FEN1辅助RPA（即FARPA），将入侵反应（Invader）与RPA整合在单管中[19]。FARPA是一种一管法检测，具有高特异性，能够从大量野生型背景中以很低丰度检出单碱基突变。

在本研究中，我们尝试采用FARPA构建了一个集成了混合蜡相纯化模块、磁流体模块、简单加热模块和便携式荧光检测模块的POCT系统，称为MINT。以blaKPC-2基因为检测目标的结果表明，所提出的POCT系统灵敏且快速，为通过耐药基因的现场快速诊断及时为医生提供治疗建议提供了实用工具。

章节摘要

材料与DNA模板制备

关于材料和DNA模板的详细情况见补充信息。DNA靶标信息列于表S1，引物和探针序列列于表S2。

裂解缓冲液由混合配方组成，结合了用于微生物直接PCR的裂解缓冲液（MDP）（Takara Bio Inc.，日本滋贺）与病毒转运培养基。MS-I、MS-II和MS-III是通过以不同比例混合病毒转运培养基和MDP制备的混合裂解缓冲液。

所提出POCT系统MINT的机制

MINT主要由三部分组成（图1a）：一次性PDMS芯片、外部磁体移动和加热模块，以及手掌大小的荧光读数模块。整个平台设计为直接检测临床样本（如尿液），无需任何预处理，在40分钟内实现"从样本到结果"的分子诊断流程。

在操作过程中，芯片被插入磁热控制模块中，通过磁珠进行核酸提取和纯化。

结论

在此，我们提出了MINT平台用于即时分子诊断，将核酸提取、扩增和检测集成到兼容的芯片中。提取通过混合蜡实现，该蜡在室温下保持固态（便于储存），在50°C时熔化（能够洗脱抑制剂）；因此，无需使用乙醇进行DNA纯化。磁珠将捕获的DNA直接携带至FARPA反应腔，减少了手动操作步骤。该平台

CRediT作者贡献声明

黄金玲：指导、资源。庞书韵：资源、调查。王珊珊：资源、调查。王玉萌：资源、调查。冯丽英：项目管理。马怡：资金获取。吴海平：资源、项目管理。周国华：撰写—审阅与编辑、指导、资源、项目管理、资金获取、概念化。徐昭罗：撰写—初稿、验证、资源、方法学、调查、形式分析

数据可用性

数据将应请求提供。

利益冲突声明

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致谢

本工作由国家自然科学基金资助（22474058, 22504060）。

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