氧浓度在α-二羰基化合物诱导人血清白蛋白形成荧光性和非荧光性晚期糖基化终末产物（AGEs）中的体外作用

《ZEITSCHRIFT FUR GERONTOLOGIE UND GERIATRIE》：The role of oxygen in the formation of fluorescent advanced glycation end products from α-dicarbonyl compounds

　　

背景：晚期糖基化终末产物（AGEs）是异质性化合物，既可内源性生成，也可通过加热食物外源性摄入。AGEs随时间在细胞和组织中积累，增加氧化应激，从而通过炎症促进衰老过程。组织中的生理氧浓度显著低于大气氧（约21%）；然而，大多数实验研究在大气条件而非生理相关氧水平下进行。目的：本研究旨在体外评估乙二醛（GO）和甲基乙二醛（MGO）诱导的AGEs形成的氧依赖性。材料与方法：在本研究中，研究人员使用CLARIOstar酶标仪测量人血清白蛋白（HSA）在不同氧浓度下与GO或MGO孵育时的AGE相关荧光强度。荧光性AGEs采用激发波长330/360 nm和发射波长405/440 nm定量。非荧光性AGEs，如羧甲基赖氨酸（CML）和甲基乙二醛衍生氢咪唑酮1（MG-H1），通过免疫印迹检测。结果：HSA与GO或MGO孵育后AGEs形成增加，呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性模式。在所测试的氧条件之间未观察到统计学显著差异。结论：这些发现提示，在本体外研究所用实验条件下，糖基化在所测试氧条件间无显著差异。有必要进一步研究氧对体内糖基化的影响，其中额外调控机制可能发挥作用。

论文解读

研究背景与问题方面，晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）是异质性化合物，既可内源性生成，也可通过加热食物外源性摄入。AGEs在细胞和组织中随时间积累，增加氧化应激，并通过炎症促进衰老过程。该反应即非酶糖基化或褐变反应，由Louis Camille Maillard于1912年首次描述，是氨基酸与还原糖之间的非酶反应，主要靶向蛋白质中的赖氨酸和精氨酸残基。AGEs作为该反应产物，是不可逆修饰，其清除仅依赖蛋白质降解及后续替换。非酶反应初始阶段生成不稳定中间体，随后经非酶稳定化形成不可逆蛋白质修饰。糖基化后，蛋白质具有归类为AGEs的翻译后修饰。这些产物及其主要细胞受体RAGE（receptor for advanced glycation end products，晚期糖基化终末产物受体）参与多条信号通路，包括核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）、转化生长因子β（transforming growth factor beta, TGF-β）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2, ERK1/2）。因此，AGEs促进氧化应激和炎症增强，在心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病及其他年龄相关疾病中发挥关键作用。乙二醛（glyoxal, GO）和甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）是来自代谢途径的反应性二羰基代谢物，是AGEs形成的主要前体。尽管已知氧化应激可诱导蛋白质糖基化，但氧浓度的作用仍不清楚。组织氧调节对支持心肌功能和细胞平衡重要；大气氧约为21%，而哺乳动物组织生理氧水平远低于此，并随器官、血管腔和局部细胞微环境而变化。因此，常规细胞培养条件可能无法准确复制体内细胞所暴露的氧环境。氧化还原稳态破坏和病理重塑可由氧化应激或缺氧引起，并伴随氧水平改变。缺氧可触发广泛分子和细胞适应，包括代谢、红细胞生成、血管生成、神经生成、线粒体转运和自噬改变。在心血管疾病中，缺血（低氧）可能改变AGEs形成或反应性羰基产生，糖基化与氧失衡之间的相互作用可能促进心脏炎症、代谢紊乱和病理重塑。既往研究显示AGEs促进心血管功能障碍，但AGEs如何影响心血管系统仍不清楚。因此，研究人员旨在检查糖基化反应是否受氧调节，并强调GO和MGO在AGEs形成中的作用。

研究人员开展了体外研究，采用人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）与GO或MGO在不同氧浓度下孵育，检测AGE相关荧光强度以及非荧光性AGEs如羧甲基赖氨酸（carboxymethyl lysine, CML）和甲基乙二醛衍生氢咪唑酮1（methylglyoxal-derived hydroimidazolone1, MG-H1）。结果显示，AGEs形成随GO或MGO浓度和时间增加，但所测试氧条件间无统计学显著差异。结论提示，在本体外实验条件下，糖基化未显著受所测氧浓度影响；但这些发现不排除氧对糖基化可能影响，且该简化受控系统不反映生物体全部复杂性，需进一步采用现实体内模型研究。其意义在于提示氧水平、二羰基应激和内皮反应之间的相互作用应在长期模型中评估，以更好理解氧如何通过糖基化影响AGE相关疾病。

关键技术方法概括（不超过250字）：研究使用带大气控制单元的CLARIOstar? Plus微孔板读数仪，独立调节O₂和CO₂；在1%、5%、21% O₂气相设定点、37 °C、5% CO₂下，将HSA与GO或MGO孵育48 h；以330/405 nm和360/440 nm激发/发射检测AGEs内在荧光，每2 h读取；采用dot blot免疫分析检测CML和MG-H1，并以总蛋白染色归一化；统计使用one-way ANOVA、two-way ANOVA、two-way重复测量ANOVA及Tukey多重比较。HSA fraction V来自Bio&Sell (Feucht, Germany)，非临床队列。

研究结果部分保留原文小标题。浓度依赖性（Concentration dependency of AGEs formation）：HSA在1%、5%和21% O₂下与0.5–2 mM GO或MGO孵育48 h，测330/405 nm和360/440 nm荧光；在21% O₂下，GO和MGO均诱导剂量依赖性荧光增加，MGO总体强度更高；在5%和1% O₂下观察到类似剂量依赖趋势。时间依赖性（Time dependency of AGEs formation）：HSA与1 mM GO或1 mM MGO在1%、5%和21% O₂下孵育至48 h，监测330/405 nm荧光；在21% O₂下，GO和MGO诱导荧光随时间进行性增加，MGO较GO和天然HSA更明显；two-way重复测量ANOVA显示时间效应P < 0.0001，时间×处理交互作用P = 0.0001，处理主效应不显著P = 0.0818，提示GO和MGO相较单独HSA诱导不同的时间依赖性AGEs荧光增加。氧依赖性（Oxygen dependency of AGEs formation）：为评估GO或MGO诱导的糖基化是否氧依赖，测HSA与1 mM GO或1 mM MGO在1%、5%和21% O₂下48 h荧光；对1 mM GO，时间主效应F(1.738, 20.85) = 186.7，P < 0.0001，氧主效应F(2, 12) = 0.1249，P = 0.8837，时间×氧交互作用F(3.476, 20.85) = 0.8800，P = 0.4806；48 h终点两两比较中，1% vs 5%、1% vs 21%和5% vs 21% O₂平均差异小、95%置信区间跨零、校正P值约0.8–0.9。对1 mM MGO，时间主效应F(1.317, 15.81) = 117.9，P < 0.0001，氧主效应F(2, 12) = 0.07351，P = 0.9295，时间×氧交互作用F(2.634, 15.81) = 0.8278，P = 0.4845。结论为荧光随时间显著增加，而氧浓度未显著影响时程或终点AGE相关荧光。CML和MG-H1形成及其受氧水平调节（CML and MG-H1 formation induced by GO or MGO and its modulation by oxygen levels）：HSA与0.5、1和2 mM GO或MGO在21%、5%和1% O₂下孵育48 h，用dot blot检测GO诱导的CML和MGO诱导的MG-H1；信号强度随GO和MGO浓度增加，CML和MG-H1水平经总蛋白归一化；尽管GO和MGO诱导信号呈浓度依赖性增加，氧条件间无统计学显著差异，two-way ANOVA及多重比较显示组间无显著差异（ns, P > 0.05）。

讨论部分总结：AGEs可修饰多种细胞外和细胞内蛋白质，改变其结构和功能；已知靶标包括血清白蛋白、血红蛋白、IV型胶原、组蛋白及关键代谢和调节蛋白。除结构修饰外，AGEs可通过NADPH氧化酶和NF-κB促进细胞内氧化应激和炎症。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt）、Janus激酶/信号转导与转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT）及MAPKs等信号通路与配体-受体相互作用相关，参与下游效应传播。AGEs可与蛋白质形成共价交联，导致结构修饰，可能破坏正常蛋白质功能；这些交联复合物可能降低蛋白质周转并促进氧化应激。因此，AGEs积累与代谢失调和糖尿病并发症发展相关。从血管角度看，此类化学修饰预期随时间积累并重塑内皮细胞蛋白质网络。缺氧是氧可用性降低的生理条件，可触发能量代谢、红细胞生成、血管生成、神经生成、线粒体动力学和自噬等多种分子和细胞反应；内皮细胞对氧张力波动尤其敏感。缺氧肿瘤细胞发生从线粒体呼吸到无氧糖酵解的深刻代谢重编程，糖酵解偏向增加反应性二羰基产生，导致AGEs在缺氧肿瘤区域积累，对肿瘤生长和治疗耐药有重要影响。在心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）模型中，缺血心脏组织中AGE–RAGE轴激活增加，改变缺血再灌注期间心肌代谢和功能；RAGE抑制可减轻组织损伤并改善心肌功能和能量代谢。既往研究显示缺氧条件下内皮细胞AGE积累更高，提示氧可用性与糖基化之间存在潜在联系；但尚不清楚该关联在多大程度上反映糖基化化学本身直接氧依赖性，还是缺氧驱动细胞和代谢反应（如反应性羰基种类和氧化应激增加）的结果。本研究探究由反应性二羰基驱动、独立于细胞环境的糖基化反应是否天然氧依赖；研究人员在不同氧水平下、不同浓度GO和MGO存在时分析AGEs形成，评估体外糖基化机制。在这些受控条件下，氧可用性未显著影响AGE形成；但由于反应混合物中溶解氧浓度未直接测量，这些发现应解释为读数仪腔室控制的标称气相O₂条件，而非直接验证的溶解氧浓度效应。

结论翻译：研究人员的发现提示，在本研究所用实验条件下，体外所测氧浓度间糖基化无显著差异；然而，这些发现不排除氧对糖基化可能影响，并且必须记住这些系统是简化且受控的，不反映生物体的全部复杂性。因此，结果应谨慎解释并考虑该模型局限。在体内，许多生理、代谢和免疫过程相互作用，可强烈影响AGEs积累和缺氧相关糖基化效应。在细胞和生物体中，AGEs积累可能受氧可用性影响的上游生物过程影响。需要更多使用现实体内模型的研究，以更好理解氧如何通过糖基化影响AGE相关疾病。特别应长期评估能够使氧水平、二羰基应激和内皮反应相互作用的模型。