《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Endothelial exosomes remodel chromatin accessibility and superenhancer in cancer cells to promote liver metastatic colonization
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肝脏器官特异性转移发生于葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）和胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）等癌症中，是终末期患者死亡的主要原因。定殖（colonization）是转移级联反应中的
肝脏器官特异性转移发生于葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）和胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）等癌症中，是终末期患者死亡的主要原因。定殖（colonization）是转移级联反应中的限速且汇聚的关键步骤。肝定殖的驱动因素在很大程度上仍不清楚。在本报告中，研究人员假设先驱转录因子（pioneer transcription factors, TFs）能够增加染色质可及性和超级增强子（superenhancer, SE）重塑，进而通过驱动相应SE相关基因的转录，促进与定殖相关的细胞特征（如增殖、存活、癌症干细胞（cancer stem cells, CSCs）、运动性）。研究人员通过ATAC-seq和ChIP-seq验证了这一假设，发现先驱TF KLF4促进了染色质可及性和SE重塑。染色质可及性和SE重塑显著增加了SE相关基因MCL1和RASGRP3的转录，从而促进了增殖、运动性和转移。此外，周围内皮细胞分泌的含有RN7SL2的外泌体促进了UM细胞中KLF4表达的上调。临床数据集分析显示，RIG-I、STAT1、KLF4和RASGRP3的过表达分别与UM和PDAC患者较短的无转移生存期或总生存期相关。总之，exoRN7SL2-STAT1-KLF4-SEs-RASGRP3信号轴的鉴定可能有助于阐明肿瘤细胞与内皮微环境相互作用介导的转移定殖机制，并可能提供新颖且可行的治疗靶点。
论文解读文章
研究背景与科学问题
远端器官转移是恶性肿瘤的标志之一，也是导致癌症患者死亡的直接原因。然而，由于转移机制的复杂性，有效的治疗方案十分有限。一些癌症表现出器官特异性的转移模式，例如葡萄膜黑色素瘤（UM）和胰腺导管腺癌（PDAC）倾向于发生肝脏特异性转移。UM患者中约85%的转移病例仅累及肝脏，而PDAC患者在初诊时即有50%-80%发生肝转移。转移是一个多步骤的复杂过程，包括癌细胞的迁移、侵袭、循环以及最终在宿主器官中定殖。其中，定殖被认为是转移级联反应中的限速步骤。已有证据表明，表观遗传改变而非遗传差异存在于原发灶和转移灶之间。因此，揭示肝转移定殖的表观遗传调控机制对于开发新的治疗策略至关重要。本研究旨在探索先驱转录因子如何通过重塑染色质可及性和超级增强子（SE）来驱动肝转移定殖。
研究方法概述
研究人员采用体内连续筛选的方法，通过将Mel270-Luc细胞经脾内注射至NOG小鼠，经过三轮体内选择获得高肝转移能力的Mel270-HM3亚系。利用染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）分析H3K27ac修饰图谱以鉴定SE区域，并结合RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化。通过转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）评估染色质开放性。采用慢病毒介导的基因敲低和过表达技术进行功能验证。使用体外共培养体系模拟肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用。利用临床样本（来自中山大学眼科中心的65例UM组织标本和18例正常对照组织）以及公共数据库（TCGA、GEO GSE71729、GSE27831）进行相关性分析和预后评估。
研究结果
1. 肝转移定殖倾向与UM细胞中SE重塑相关
通过体内筛选获得的Mel270-HM3亚系相比亲代细胞，其肝脏转移能力显著增强。ChIP-seq分析显示，HM3亚系中获得了563个新增的SE区域，同时失去了1030个SE区域，表明发生了显著的SE重塑。GO分析显示这些SE相关基因富集于上皮间充质转化、细胞外泌体、抗凋亡和细胞增殖等通路。
2. CDK7在UM中过表达且促进转移定殖
CDK7作为执行SE功能的关键激酶，在HM3亚系中mRNA和蛋白水平均显著升高，且活性增强。TCGA数据分析显示CDK7在高侵袭性UM中高表达，并与不良预后相关。GEO数据集分析表明，伴有肝转移的PDAC患者原发灶中CDK7 mRNA水平更高。IHC染色证实CDK7在UM组织中高表达，且与肿瘤厚度、基底直径及TNM分期正相关。
3. 抑制CDK7可消除转移定殖
使用CDK7选择性抑制剂THZ1处理UM细胞，可有效抑制RNA聚合酶II CTD的磷酸化。在体内模型中，THZ1治疗显著降低了肝转移的BLI信号强度、肝表面结节数量和转移灶面积。同样，通过shRNA敲低CDK7也显著抑制了肝转移能力。
4. THZ1抑制增殖和肿瘤生长
THZ1对UM细胞具有纳摩尔级别的IC50值，而对正常ARPE-19细胞毒性较低。THZ1显著抑制了克隆形成能力以及Omm1异种移植瘤和MP41 PDX模型的肿瘤生长，Ki67染色证实增殖受到抑制。
5. MCL1是SE相关的促存活基因
THZ1诱导UM细胞大量凋亡，伴随Mcl-1蛋白水平下降。ChIP-seq数据显示MCL1为SE相关基因，THZ1可降低其mRNA水平。过表达Mcl-1可部分挽救THZ1诱导的凋亡，而沉默Mcl-1则增加药物敏感性。
6. THZ1降低CSC特性
THZ1处理降低了SLUG蛋白水平，抑制了黑素球形成能力，减少了Aldefluor+细胞比例。体内有限稀释实验证实THZ1降低了CSC频率。
7. THZ1降低细胞运动性
Transwell实验显示THZ1抑制了UM细胞的迁移和侵袭能力。THZ1减少F-actin荧光强度，抑制RhoA活性及其下游ROCK信号通路。
8. RASGRP3是关键SE相关基因
通过低浓度THZ1处理结合RNA-seq分析，筛选出8个候选SE相关基因，其中RASGRP3在UM细胞中表达最高。TCGA和GEO数据显示RASGRP3高表达与UM患者不良预后相关。在体内实验中，过表达RASGRP3促进了肝转移，并可部分逆转THZ1的抗转移作用。
9. RASGRP3通过ERK/ELK1/SLUG轴维持CSC特性
沉默RASGRP3降低了ERK1/2和ELK1的磷酸化以及SLUG的表达，减少了黑素球形成和Aldefluor+细胞比例。ChIP实验证实RASGRP3影响p-ELK1在SLUG启动子区的富集。
10. RASGRP3通过RhoA/ROCK通路调节细胞运动性
沉默RASGRP3减少了F-actin形成和细胞迁移侵袭能力，降低了活性RhoA水平。过表达RASGRP3可逆转THZ1对运动性的抑制作用。
11. 内皮细胞共培养诱导SE重编程
与HUVECs共培养后的Mel270细胞表现出更强的肝转移能力。ChIP-seq分析显示共培养后72.1%的SE区域信号增强。基序富集分析发现KLF4结合位点在获得的SE区域中高度富集。
12. KLF4介导SE重编程
共培养后KLF4转录水平显著上调。在HM3亚系中KLF4表达升高，且在转移性UM患者中表达更高。敲低KLF4导致H3K27ac在SE区域的信号减弱。ATAC-seq分析显示，在CFPAC-1细胞中敲低KLF4导致约80%的开放染色质区域减少，包括MCL1和RASGRP3位点。过表达或敲低KLF4分别促进或抑制了UM和PDAC细胞的肝转移能力。
13. 内皮来源外泌体RN7SL2激活RIG-I-STAT1-KLF4信号轴
STAT1可直接结合KLF4启动子并调控其表达。HUVECs的条件培养基可上调UM细胞中RIG-I、STAT1和KLF4的水平，而去除外泌体后此效应消失。荧光标记实验证实HUVECs来源的外泌体可被UM细胞摄取。静脉注射HUVECs来源的外泌体促进了UM细胞的肝转移。进一步研究发现，外泌体中的RN7SL2 RNA分子通过激活RIG-I受体，启动STAT1磷酸化，进而上调KLF4表达。
总结与意义
本研究揭示了exoRN7SL2-STAT1-KLF4-SEs-RASGRP3这一全新的信号轴在肝转移定殖中的关键作用。研究结论表明：肝窦内皮细胞分泌的含有RN7SL2的外泌体被肿瘤细胞摄取后，激活RIG-I-STAT1信号通路，上调先驱转录因子KLF4的表达；KLF4作为先驱因子重塑染色质可及性和超级增强子，进而驱动SE相关基因MCL1（促进存活）和RASGRP3（通过ERK/ELK1/SLUG轴维持CSC特性并通过RhoA/ROCK通路促进运动性）的转录，最终促进肝转移定殖。该研究不仅阐明了肿瘤细胞与肝脏内皮微环境相互作用驱动转移定殖的分子机制，而且为UM和PDAC等肝脏嗜转移性癌症提供了潜在的治疗靶点。该论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
