《Pharmaceutics》：Engineering Chitosan-Coated PLGA Nanoparticles for Sustained Bupivacaine Delivery: Physicochemical Performance and a Preliminary Fibroblast Cytocompatibility Assessment
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背景/目的：盐酸布比卡因（Bupi-HCl）是一种广泛使用的局部麻醉药；然而，其从给药部位的快速扩散以及浓度依赖性细胞毒性可能限制其局部治疗效果。本研究旨在开发壳聚糖包覆的聚（D,L-丙交酯-co-乙交酯）（PLGA）纳米粒，用于盐酸布比卡因的持续递送，并评价
背景/目的：盐酸布比卡因（Bupi-HCl）是一种广泛使用的局部麻醉药；然而，其从给药部位的快速扩散以及浓度依赖性细胞毒性可能限制其局部治疗效果。本研究旨在开发壳聚糖包覆的聚（D,L-丙交酯-co-乙交酯）（PLGA）纳米粒，用于盐酸布比卡因的持续递送，并评价其理化性质、释放行为、长期稳定性及与成纤维细胞的生物相容性。方法：采用改良双乳化溶剂挥发法制备载盐酸布比卡因的壳聚糖包覆PLGA纳米粒（Bupi-CS-PLGA NPs），并通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、差示扫描量热法（DSC）、X射线衍射（XRD）、包封率（EE）、载药量（DL）、体外释放、释放动力学模型拟合、12个月理化稳定性以及基于MTT法的成纤维细胞初步生物相容性评价对其进行表征。结果：Bupi-CS-PLGA NPs呈 predominant 球形形态，平均粒径为175.13 ± 8.10 nm，多分散指数（PDI）为0.195 ± 0.026，Zeta电位为+24.86 ± 1.90 mV。包封率和载药量分别为80.00 ± 2.14%和2.60 ± 0.11%。FTIR结果与Bupi-HCl在PLGA/壳聚糖基质中的物理包埋一致，未发现新化学键形成的证据；DSC显示纳米粒制剂的熱谱图存在差异；XRD显示Bupi-HCl未以独立结晶相形式被检测到。该纳米粒在72 h内提供Bupi-HCl的持续释放，累积释放率约为79–80%，而游离Bupi-HCl为97–98%。在所评价的动力学模型中，修正Langmuir模型和RRSBW模型的决定系数最高（R2 = 0.9958和0.9952），其中RRSBW模型的总残差值最低（19.5851）。在冷藏和室温条件下储存12个月期间，理化特性得以维持。在单次实验运行中，空白CS-PLGA NPs在所测试浓度范围内未显示MTT信号降低。Bupi-CS-PLGA NPs在250和500 μg/mL浓度下的MTT信号低于两个较低颗粒浓度（62.5和125 μg/mL）下的信号；未排除颗粒相关检测干扰。由于未在剂量等效浓度下评价游离和包封的Bupi-HCl，无法直接比较其细胞毒性效力，这些单次实验结果仅作为初步评价报告。结论：Bupi-CS-PLGA NPs提供了持续药物释放和长期理化稳定性，同时伴有初步的、受检测方法限制的成纤维细胞MTT评价结果。这些发现支持对该可生物降解纳米粒系统用于Bupi-HCl局部持续递送进行进一步评价。
论文解读
一、研究背景与意义
盐酸布比卡因（Bupi-HCl）是一种长效酰胺类局部麻醉药，广泛应用于浸润麻醉、外周神经阻滞、硬膜外麻醉和蛛网膜下腔麻醉。然而，传统制剂存在明显局限：游离药物在局部给药后易从给药部位扩散离开，导致局部药物浓度逐渐降低、作用持续时间缩短；高浓度暴露可诱导浓度依赖性局部细胞毒性，影响成纤维细胞等参与组织修复和伤口愈合的正常细胞的活力；全身吸收还可能引发心血管和中枢神经系统毒性。这些局限性凸显了对更安全、更可控的局部药物递送系统的需求。
可生物降解聚合物纳米粒为局部麻醉药的控制递送提供了有前景的策略。将药物包封于聚合物基质中可控制释放、减少快速暴露并确保长期药物可用性。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）因其生物相容性、可调降解行为以及通过扩散和聚合物降解提供持续药物释放的能力，成为最广泛研究的可生物降解控释聚合物之一。然而，用天然聚合物包覆PLGA纳米粒可进一步修饰其表面性质和释放行为。壳聚糖是一种可生物降解、生物相容的阳离子多糖，含可质子化氨基，可赋予PLGA纳米粒正电荷，增强其与带负电荷生物表面的相互作用，同时有助于维持胶体稳定性并提供额外的扩散屏障。
尽管已有研究探索了脂质体、微粒和聚合物递送系统以延长布比卡因的局部作用，但针对载布比卡因的壳聚糖包覆PLGA纳米粒（Bupi-CS-PLGA NPs）在原发性成人真皮成纤维细胞中的系统评价仍有限。成纤维细胞参与细胞外基质和胶原合成及组织重塑，而高浓度局麻药可对其活力产生不利影响。因此，本研究旨在对Bupi-CS-PLGA NPs进行整合评价，涵盖形态学、粒径、Zeta电位、化学结构、热行为、结晶度、包封率、载药量、持续释放行为、长期理化稳定性、释放动力学、初步成纤维细胞生物相容性及探索性DPPH自由基清除响应。该研究的创新性不在于单独使用PLGA或壳聚糖，而在于对壳聚糖包覆PLGA纳米粒系统中Bupi-HCl的综合评价，结合了详细的理化及固态表征、持续释放评价与动力学建模、12个月理化稳定性以及原发性成人真皮成纤维细胞中的初步生物相容性评价。
二、主要技术方法
研究人员采用改良双乳化溶剂挥发法（水/油/水，w/o/w）制备Bupi-CS-PLGA NPs，以PLGA为聚合物基质、壳聚糖为表面包覆层。表征手段包括：透射电子显微镜（TEM）观察形态；动态光散射（DLS）测定粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位；傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析化学结构；差示扫描量热法（DSC）评价热行为；X射线衍射（XRD）分析结晶状态；紫外-可见分光光度法测定包封率（EE）和载药量（DL）。体外释放研究采用Franz扩散池，释放数据拟合至九种动力学模型。稳定性研究在冷藏（5 ± 2 °C）和室温（25 ± 2 °C/60 ± 5%相对湿度）条件下进行12个月。细胞实验采用正常人成人真皮成纤维细胞（HDFa；ATCC PCS-201-012，传代24次），通过MTT比色法评价生物相容性。DPPH法作为探索性化学自由基清除评价。
三、研究结果
3.1 理化表征
所制备的Bupi-CS-PLGA NPs分散液外观均匀、乳白色不透明，无可见沉淀、聚集或相分离。TEM显示空载和载药纳米粒均呈球形或近球形，表面相对光滑，分散良好。DLS测定空载CS-PLGA NPs的平均水动力粒径为161.150 ± 5.601 nm，PDI为0.148 ± 0.012，Zeta电位为+24.104 ± 1.021 mV；载药后粒径增至175.132 ± 8.103 nm，PDI为0.195 ± 0.026，Zeta电位为+24.861 ± 1.90 mV。正Zeta电位间接证实壳聚糖成功包覆。
3.1.1 傅里叶变换红外光谱
FTIR分析显示，纯Bupi-HCl在约3450 cm?1处有N–H伸缩振动带，2950–2850 cm?1范围有脂肪族C–H伸缩带，1600–1650 cm?1区域有芳香环和N–H弯曲振动，1300–1000 cm?1范围有C–N和C–O振动。PLGA在约1750 cm?1处显示酯羰基（C=O）强特征峰，1180–1080 cm?1范围有C–O–C伸缩振动。壳聚糖在3200–3500 cm?1范围显示O–H/N–H伸缩带，1590–1650 cm?1区域有氨基和酰胺基特征吸收带。载药纳米粒中PLGA和壳聚糖的特征带均保留，部分Bupi-HCl特征峰强度降低并有轻微波数位移，但未形成新吸收带，表明药物以物理包埋方式存在于聚合物基质中。
3.1.2 差示扫描量热法
PLGA 75:25在43.4–50.5 °C范围显示玻璃化转变行为，92.3 °C处有吸热转变峰，无显著熔融吸热峰，符合其无定形本质。壳聚糖在约44.9–104.2 °C区域显示低温吸热特征，可能与吸附水和结合水损失有关，近330 °C处有高温热事件。纳米粒制剂的热谱图与单一聚合物组分不同，载药纳米粒的热事件在位置、强度和宽度上均有变化，呈现更宽泛、更不明显的热特征。
3.1.3 X射线衍射
纯Bupi-HCl显示多个尖锐强衍射峰，主要峰位于2θ = 9.57°、9.87°、19.05°、19.29°和24.94°，证实其结晶性质。壳聚糖在2θ = 11.15°和20.02°处显示典型峰。PLGA呈宽衍射图谱，符合其无定形状态。空载和载药纳米粒均显示宽衍射图谱，在约2θ = 19–20°处有显著聚合物相关衍射峰，但纯Bupi-HCl的独特结晶反射在载药纳米粒中无法区分，表明药物未以独立结晶相存在。
3.1.4 包封率和载药量
通过UV-Vis分光光度法在201 nm处建立标准曲线（y = 0.0395x ? 0.0453，R2 = 0.999，线性范围2–20 μg/mL）。Bupi-CS-PLGA NPs的包封率为80.00 ± 2.14%，载药量为2.60 ± 0.11%。
3.2 体外药物释放研究
Franz扩散池释放实验显示，游离Bupi-HCl溶液释放迅速，4 h内释放约77%，8 h达85%，72 h达97–98%。Bupi-CS-PLGA NPs释放明显减缓，前4 h释放约30%，8 h和12 h分别为39%和47%，24 h约59%，36 h约68%，72 h约79–80%。九种动力学模型拟合结果显示，修正Langmuir模型和RRSBW模型的决定系数最高（R2 = 0.9958和0.9952），RRSBW模型总残差值最低（19.5851）。由于多个模型均能较好描述释放曲线，动力学结果被解释为释放曲线的数学描述而非特定释放机制的确证。
3.3 生物相容性评价
MTT法评价结果显示，空载CS-PLGA NPs在所测浓度范围（31.25–500 μg/mL）内MTT信号均接近未处理对照组水平（97.9%–119.2%），未检测到信号降低。游离Bupi-HCl呈浓度依赖性降低MTT活力：31.25 μg/mL时为76.3%，500 μg/mL时降至17.5%。Bupi-CS-PLGA NPs在62.5和125 μg/mL时MTT信号较高（93.8%和85.2%），与对照组无显著差异；在250和500 μg/mL时信号显著降低（35.4%和45.9%），且500 μg/mL信号高于250 μg/mL，呈非单调模式。由于载药量仅2.60%，62.5–500 μg/mL颗粒浓度对应名义Bupi-HCl等效浓度仅为1.63–13.0 μg/mL，低于直接测试的最低游离药物浓度31.25 μg/mL，因此无法直接比较游离与包封药物的细胞毒性效力。
3.4 DPPH实验
DPPH实验以原始吸光度报告。游离Bupi-HCl在10 μg/mL时吸光度为0.1057 ± 0.0006，空载和载药纳米粒在10 μg/mL时分别为0.1450 ± 0.0036和0.2323 ± 0.0085，在1000 μg/mL时分别为2.8923 ± 0.0836和2.6110 ± 0.0407。由于未测量浓度匹配的无DPPH样品空白，纳米粒吸光度曲线不能解释为定量DPPH自由基清除活性。
3.5 稳定性研究
在12个月储存期间，无论冷藏（5 ± 2 °C）还是室温（25 ± 2 °C/60 ± 5%相对湿度）条件，Bupi-CS-PLGA NPs的粒径、PDI和Zeta电位均基本保持稳定，仅粒径有微小变化，PDI保持低值，正表面电荷维持，表明胶体性质在储存期间得以保持。
四、讨论与结论
讨论部分指出，球形纳米粒具有较低表面自由能，不易聚集，物理稳定性更好。载药仅引起粒径轻微增加且PDI保持在0.20以下，表明药物包埋未损害制剂均一性。正Zeta电位间接证实壳聚糖成功包覆。FTIR、DSC和XRD结果共同支持Bupi-HCl在PLGA/壳聚糖基质中的物理包埋而非化学结合。高包封率表明改良双乳化溶剂挥发法有效保留了亲水性药物。持续释放行为可能与PLGA基质结构特征和壳聚糖包覆层提供的额外扩散屏障有关。动力学分析强调不应仅依据R2选择单一最佳模型。稳定性结果证实制剂在12个月储存期间保持胶体稳定性。MTT结果作为初步评价，存在颗粒相关干扰未排除、单次实验技术重复而非生物学重复、传代24次等局限性。DPPH数据因缺少样品空白而仅作为探索性原始吸光度曲线报告。
研究结论为：Bupi-CS-PLGA NPs成功制备并全面表征，具有均一球形形态、窄粒径分布、正表面电荷和高效药物包封，12个月储存期间保持理化特性。理化表征支持Bupi-HCl物理包埋于PLGA/壳聚糖基质中，无新化学键形成，XRD未检测到独立结晶相。与游离药物相比，纳米粒制剂在72 h内提供持续释放。Bupi-CS-PLGA NPs在62.5和125 μg/mL时MTT信号较高，在250和500 μg/mL时较低，但高浓度信号不能确定为细胞死亡，因缺少颗粒特异性干扰对照和独立活力终点。由于未在剂量等效浓度下比较游离与包封药物，这些发现不能解释为包封降低了Bupi-HCl细胞毒性。综合理化特性、持续释放行为、长期理化稳定性和初步MTT观察结果，支持进一步评价Bupi-CS-PLGA NPs作为Bupi-HCl持续递送的可生物降解载体。未来研究应包括与游离Bupi-HCl的剂量等效比较、独立生物学实验中采用互补活力终点确认初步MTT发现，以及体内药代动力学、疗效和安全性评价。
