JAG1-siRNA脂质纳米颗粒抑制婴幼儿血管瘤血管生成的作用及机制研究

《Pharmaceutics》：JAG1-siRNA-Lipid Nanoparticles Suppress Infantile Hemangioma Angiogenesis

　　

摘要 背景：婴幼儿血管瘤（Infantile Hemangioma, IH）是婴儿期最常见的良性血管肿瘤，目前的一线治疗药物普萘洛尔（propranolol）需要长期每日两次给药，且存在全身性不良反应。方法：研究人员利用公开的GSE127487转录组数据集，结合加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）网络分析，鉴定出JAG1——一种主要的内皮Notch配体——为疾病PPI网络中连接度最高的节点，其在IH的所有临床阶段均呈现高表达。为验证其作为药物靶点的可行性，研究人员构建了一种由SM-102/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000组成的脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP），用于递送JAG1特异性小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）。结果：在氮磷比（N/P ratio）为8时，该制剂可高效包封siRNA，保护其免受血清核酸酶降解，并保持胶体稳定性。LNP介导的JAG1敲低在体外可减少血管瘤干细胞（Hemangioma Stem Cells, HemSCs）的Matrigel网络形成。在血管瘤异种移植模型中，瘤内递送JAG1 siRNA可使肿瘤体积减少约75%，肿瘤重量减少约80%，微血管密度（Microvessel Density, MVD）减少超过一半，且未观察到明显的毒性（基于体重及临床观察指标）。结论：在该临床前模型中，JAG1是一个可靠的潜在治疗靶点，LNP递送的JAG1 siRNA是一种有前景的、针对IH血管生成的基因沉默策略。

婴幼儿血管瘤靶向治疗新策略：JAG1-siRNA脂质纳米颗粒的临床前研究解读

一、研究背景与问题提出

婴幼儿血管瘤（Infantile Hemangioma, IH）是婴儿期最常见的良性血管肿瘤，发病率约为4%–5%，多见于女婴、早产儿及低出生体重儿。肿瘤由GLUT1阳性内皮细胞构成，其临床病程具有可预测性：出生后数月内快速增殖，随后进入平台期，再经历数年缓慢自发消退。多数小病灶可安全观察等待，但位于眼周、气道、内脏或合并溃疡、出血及功能障碍的血管瘤则需要积极甚至紧急干预。

目前，普萘洛尔是IH的一线治疗药物，但存在明显不足：需每日两次口服给药并持续数月，可能引起低血糖、睡眠障碍及呼吸道感染等不良反应，部分病灶反应不完全或停药后复发。因此，临床上亟需一种能够针对明确分子驱动因子、实现局部作用且避免全身暴露的新型治疗策略。

Notch信号通路是血管发育、动静脉分化及内皮稳态的核心调控通路。在经典配体中，Jagged1（JAG1）与Delta样配体4（Dll4）在内皮中占主导地位且功能相反：Dll4通过侧向抑制限制出芽，而JAG1拮抗Dll4并促进血管分支与成熟。既往研究已表明JAG1信号可引导血管瘤干细胞向周细胞及血管平滑肌细胞分化，但尚缺乏数据驱动的证据证明JAG1是否处于IH分子网络的核心位置，也缺乏将其关闭的具体手段。

二、研究内容与核心发现

研究人员首先对GSE127487转录组数据集（包含5例正常皮肤、18例未经治疗的IH标本及5例普萘洛尔治疗标本）进行分析，通过差异表达分析、WGCNA及PPI网络分析，鉴定出JAG1为疾病PPI网络中连接度最高的枢纽基因（hub gene），且在所有临床阶段均持续高表达。随后，研究人员构建了由SM-102/DSPC/胆固醇/DMG-PEG2000组成的脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle, LNP），通过后插入法装载JAG1特异性siRNA。在氮磷比（N/P ratio）为8的条件下，该制剂表现出高效的siRNA包封率、血清核酸酶保护能力及胶体稳定性。体外实验证实，LNP介导的JAG1敲低可显著减少血管瘤干细胞（Hemangioma Stem Cells, HemSCs）的Matrigel网络形成，且不影响细胞活力。在血管瘤异种移植模型中，瘤内注射LNP+JAG1 siRNA可使肿瘤体积减少约75%、肿瘤重量减少约80%、微血管密度（Microvessel Density, MVD）降低超过50%，且未观察到明显毒性。

三、主要技术方法

本研究综合运用了以下关键技术方法：基于GEO数据库的GSE127487转录组数据挖掘，采用limma进行差异表达分析；WGCNA构建基因共表达网络并鉴定与IH状态最相关的ME3模块；STRING数据库进行PPI网络构建及枢纽基因鉴定；Louvain算法进行网络社区检测；微流控混合技术制备空白LNP，后插入法装载siRNA；动态光散射（DLS）表征粒径与Zeta电位；RiboGreen法测定包封效率；琼脂糖凝胶电泳评估血清稳定性；qRT-PCR及Western blot检测基因沉默效率；Matrigel网络形成实验评估体外功能；BALB/c裸鼠异种移植模型评估体内抗肿瘤疗效，以H&E染色进行微血管密度定量。

四、研究结果

1. 转录组景观与功能富集分析

IH组织与正常皮肤比较共获得1966个差异表达基因（DEGs），其中1753个上调、213个下调，上调/下调比达8.2:1，提示IH的转录程序以增殖性激活为主。GO分析显示上调基因富集于“血管生成”“内皮细胞分化”及“细胞-基质黏附”等生物学过程；KEGG分析突出“黏着斑”“整合素信号”及“PI3K-Akt信号通路”。基因集富集分析（GSEA）最高富集于“血管内皮细胞增殖”。

2. WGCNA鉴定ME3模块及JAG1-Notch枢纽

WGCNA以软阈值β=12构建无符号网络，ME3模块（1531个基因）与IH状态相关性最强（r=0.882, p=2.65×10^-8）。该模块与DEG列表重叠的822个基因经STRING分析后，前五大枢纽基因为CDH5、ITGB1、CD4、PECAM1和CD34，构成内皮身份核心。基于全DEG列表构建的PPI网络中，JAG1为连接度最高的节点，并锚定一个包含JAG2、NOTCH3、NOTCH4、HEY1、HEYL、MFNG、ADAM17、PSEN1及LFNG的Notch信号簇。

3. JAG1在各临床阶段持续高表达

JAG1在IH组织中的平均表达显著高于正常皮肤（logFC=2.34, p=0.006），且标本间变异系数仅4.74%。分期分析显示，JAG1在6、12、24个月各阶段均持续高于正常组织，未随消退进程显著下降。单样本GSEA（ssGSEA）显示增殖评分随分期下降（p=0.076），而Notch评分保持稳定（p=0.52），提示Notch信号在IH全病程中持续存在。

4. siRNA-LNP制剂表征与优化

制备的空白LNP粒径在166–198 nm之间，Zeta电位+15至+35 mV。N/P=8时包封效率达90.0±1.2%，siRNA在血清中24小时保持完整，粒径在4°C储存14天内稳定。透射电镜确认球形形态。

5. LNP介导的JAG1敲低抑制体外HemSC网络形成

FITC标记的siRNA-LNP可高效结合HemSCs。LNP+JAG1 siRNA在24、48、72小时分别实现78%、93%及95%的mRNA敲低，Western blot确认蛋白水平同步下降。JAG1沉默的HemSCs在Matrigel上形成的网络总段长显著缩短，而CCK-8实验显示细胞活力无显著差异，表明该效应为网络特异性而非细胞毒性所致。

6. LNP介导的JAG1沉默抑制体内血管瘤生长

在异种移植模型中，单次瘤内注射LNP+JAG1 siRNA后48小时，肿瘤内JAG1蛋白表达降至对照组的约55%。经6次瘤内给药后，LNP+JAG1 siRNA组肿瘤体积（67±12 mm³）较对照组（248–280 mm³）减少约75%，肿瘤重量减少约80%，微血管密度从约265–293 vessels/mm²降至125±22 vessels/mm²，减少超过50%。各组小鼠体重稳定，未见明显全身毒性。

五、讨论与结论

本研究表明JAG1不仅是IH转录组网络的核心枢纽，而且是功能性驱动因子。LNP递送系统精准实现了靶向沉默：裸siRNA、空白LNP及阴性对照siRNA均无疗效，仅LNP+JAG1 siRNA组表现出显著抗肿瘤及抗血管生成效应。该制剂采用后插入法装载siRNA，避免RNA接触有机溶剂；SM-102具有临床验证记录，提供pH依赖性内体逃逸及血清核酸酶保护。局部瘤内给药路径与现有病灶内皮质类固醇注射的临床实践相衔接，具有转化可行性。

研究局限性包括：生物信息学分析基于单一公共微阵列数据集（18例IH vs 5例对照）；无法从 bulk 组织中解析细胞类型；异种移植模型不能完全模拟人类消退动力学；未进行Ki67/TUNEL增殖凋亡染色；CD31免疫组化仅基于每组的单张存档切片，仅作定性参考；血清稳定性基于单张存档凝胶半定量评估；未进行血液生化及器官组织学检查。

结论：JAG1在婴幼儿血管瘤中显著且持续上调，处于其转录组网络枢纽位置，经LNP递送siRNA沉默后，可在体外减少HemSC的Matrigel网络形成，并在体内抑制肿瘤生长及血管生成。在该临床前模型中，靶点得到原理性支持，递送载体性能可靠。局部递送的JAG1导向RNA干扰仍是针对婴幼儿血管瘤病灶特异性治疗的临床前方案，其药代动力学、全身暴露、重复给药安全性及临床相关递送方式有待进一步研究，也可能拓展至其他JAG1依赖性血管生成性疾病。