酶辅助嗜酸乳杆菌–酿酒酵母共发酵灵芝：代谢组重编程、感官演变及促睡眠效应

《Foods》：Enzyme-Assisted Bacteria–Yeast Co-Fermentation of Ganoderma lucidum: Metabolomic Reprogramming, Sensory Evolution, and Sleep-Promoting Effects

　　

为提升灵芝（Ganoderma lucidum）的提取效率与生物活性，该研究开发了一种新型酶辅助细菌–酵母共发酵系统，采用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。经响应面法（RSM）优化后，多糖和三萜的最大得率分别达到2.07%和3.55%，显著高于直接提取。结构表征显示，该集成工艺诱导多糖发生实质性变化，包括均一性增加、甘露糖富集以及更疏松的微观结构。此外，非靶向代谢组学表明，共发酵显著改变了小分子谱，表现为特定三萜的差异调控以及肽和氨基酸的富集。这些代谢变化与感官特征演变相关，尤其是味觉丰富度增加。使用对氯苯丙氨酸（PCPA）诱导失眠小鼠模型进行的体内评价显示，发酵提取物比直接提取物表现出更强的促睡眠活性。发酵提取物提高了下丘脑5-羟色胺（5-HT）和γ-氨基丁酸（GABA）水平，并伴随肠道菌群组成调节，即增加Lactobacillus丰度并降低Prevotella丰度。这些发现表明，酶–发酵联合策略可缓解失眠，可能涉及微生物–肠–脑轴的调节，为灵芝在功能性食品中的潜在应用提供了初步见解。

研究背景与问题：灵芝为多孔菌科灵芝或紫芝的干燥子实体，2025版《中国药典》称其“补气安神”。灵芝提取物具有免疫调节、睡眠增强和神经保护等作用，主要活性成分为多糖（polysaccharides）和三萜（triterpenoids）。然而，灵芝子实体致密细胞壁结构阻碍活性成分释放，传统提取效率与生物利用度较低；同时三萜等成分苦涩明显，限制其口服制剂与功能食品应用。微生物发酵是温和高效的生物转化技术，益生菌可分泌纤维素酶、糖苷酶等降解细胞壁，释放胞内活性成分，并可改造分子结构、降解苦味前体。但由几丁质和葡聚糖组成的致密细胞壁限制单一微生物酶解效率，外源酶预处理可降解真菌细胞壁，为后续微生物代谢提供可接近底物，因此酶解与细菌–酵母共发酵构成协同策略。既有研究多关注单一化学成分转化及活性变化，对多类化学成分整体转化、风味品质变化及其与生物活性关系表征不足，也缺少将化学组成、感官品质和功能活性整合的多维评价框架。为此，研究人员以灵芝子实体为底物，建立嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）–酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）双菌共发酵系统，优化工艺，分析活性成分，开展多维品质评价，并验证促睡眠功效，旨在推进灵芝子实体高值化利用，为“成分–品质–功效”关系提供方法框架，并为开发促睡眠灵芝健康产品提供工艺基础和支撑数据。

关键技术方法：灵芝子实体由安徽金寨侨康药业有限公司提供；嗜酸乳杆菌（CGMCC 1.1854）和酿酒酵母（CGMCC 2.3868）来自中国普通微生物菌种保藏管理中心；SPF雄性ICR小鼠来自杭州子源实验动物科技有限公司。研究人员采用单因素实验和Box–Behnken响应面法优化发酵时间、初始pH和接种量；以纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶预处理后进行嗜酸乳杆菌–酿酒酵母共发酵；采用化学比色法测定多糖和三萜，采用凝胶渗透色谱、离子色谱、FT-IR、SEM、¹H NMR、¹³C NMR和HSQC表征多糖；采用UPLC-QE/MS非靶向代谢组学和电子舌分析小分子与味觉；以PCPA诱导失眠小鼠模型，通过戊巴比妥睡眠试验、ELISA、H&E染色和16S rRNA测序评价促睡眠、神经递质、组织病理和肠道菌群。

研究结果：
3.1 基于响应面法优化灵芝子实体发酵过程：单因素实验评估发酵时间、温度、初始pH和接种量对总多糖和总三萜得率的影响，发现发酵时间、初始pH和接种量显著影响得率，温度影响边际。Box–Behnken设计优化后，多糖模型显著，三萜模型高度显著。综合优化条件为27 h、初始pH 5.1、接种量2.3%；实际总多糖和总三萜得率分别为2.07 ± 0.08%和3.55 ± 0.18%，预测误差仅1.24%和3.09%。与直接提取（0.44 ± 0.02%和0.69 ± 0.05%）相比，分别提高4.7倍和5.1倍。
3.2 发酵对粗多糖复合物理化性质的影响：
3.2.1 化学组成分析：GLP-PF总糖含量低于GLP-DE，而糖醛酸和蛋白含量升高。
3.2.2 分子量分布：GLP-DE呈现24.03、7.87和2.42 kDa三个不均一组分；GLP-PF呈现5.51和5.86 kDa两个较均一组分，分子量降低且分布变窄。
3.2.3 单糖组成：两者均含九种单糖，葡萄糖占比超过50%；发酵后岩藻糖和半乳糖相对含量降低，甘露糖相对含量升高。
3.2.4 FT-IR分析：GLP-DE与GLP-PF吸收峰高度相似，显示O–H、C–H、C=O、COO^?和C–O–C糖苷键等特征，表明发酵未显著改变多糖主要官能团。
3.2.5 微观形态分析：GLP-DE表面较致密、少孔；GLP-PF呈疏松三维网络、碎片、裂缝和多孔结构。
3.2.6 NMR分析：两者存在α-和β-糖苷键；GLP-DE中岩藻糖相关信号更强并出现乙酰甲基信号，GLP-PF中检测到甘露糖H-1信号。
3.3 灵芝发酵液小分子成分表征：UPLC-QE/MS非靶向代谢组学显示两组代谢谱明显不同，PCA和OPLS-DA可区分，模型R²Y和Q² > 0.5；火山图发现SM-PF相对SM-DE有3034个上调、1916个下调候选代谢物，并筛选19个关键差异候选代谢物。差异化合物共98个，主要为三萜、肽和氨基酸、脂肪酸、黄酮、香豆素和生物碱。三萜总体降低，其中lucidenic acid B等3个上调、ganoderic acid E等5个下调；肽和氨基酸总体富集，12个上调、1个下调；脂肪酸衍生物7个上调、4个下调；黄酮和香豆素总体降低；生物碱总体增加。
3.4 灵芝发酵液味觉分析：电子舌显示DE与PF组PCA分离，酸味、咸味和涩味较弱且组间相近，PF增加整体味觉复杂性。Pearson相关分析表明，鲜味与部分三萜、肽和氨基酸、脂肪酸衍生物、黄酮及生物碱正相关，与phytonadiol、lucidenic acid B和(+)-absinthin负相关；苦味与8′-apocapsorbinal、apocarotenal和(+)-absinthin正相关，与AKBA、5-hydroxytryptophan、DL-β-leucine、L-phenylalanine、myristoyl-Gly-OH、L-tyrosylglycylglycyl-L-tryptophyl-L-leucine、retusin、oleanolic acid和cephaeline负相关；苦后味与cembrene A、8′-apocapsorbinal和apocarotenal正相关，与ganoderic acid B负相关。
3.5 共发酵灵芝提取物促睡眠功效：
3.5.1 对PCPA失眠小鼠体重和睡眠行为的影响：PCPA导致模型相关组体重下降，DZP、DE-H和PF-H组体重显著恢复。睡眠试验中，DE、PF和DZP均降低睡眠潜伏期并延长睡眠时间；PF-H睡眠时间最长，显著长于低剂量组、DZP组和DE-H组。
3.5.2 下丘脑神经递质和组织病理调节：PCPA降低下丘脑5-HT、GABA和GABA/Glu比值，Glu呈非显著升高趋势；DZP、DE和PF处理显著提高5-HT、GABA和GABA/Glu比值。PF-H较DE-H更明显提高5-HT和GABA/Glu比值，并显著降低Glu。H&E染色显示PCPA组神经元皱缩、大小不规则和空泡样改变，治疗后形态异常减轻。
3.6 共发酵灵芝提取物调节肠道菌群：
3.6.1 对微生物多样性和群落结构的影响：Venn图显示NG、PCPA、DZP、DE-H和PF-H共享495个核心OTU，PF-H独特OTU最多。PCPA降低Chao1和Shannon指数；DZP、DE-H和PF-H均提高Shannon指数，PF-H恢复作用最大。β多样性显示PCPA与NG、DZP和PF菌群组成差异显著，与DE差异未达显著。
3.6.2 分类组成和微生物标志物：优势属包括Lactobacillus、Muribaculum、Bacteroides等。PCPA降低Lactobacillus丰度，DZP、DE-H和PF-H处理增加其丰度，PF-H较DE-H增加更明显。LEfSe分析显示NG有7个特征分支，PCPA以Ligilactobacillus为特征，DZP以双歧杆菌谱系为主，DE-H仅以Limosilactobacillus为标志，PF-H有7个分类标志，主要属于Lactobacillales，包括Lactobacillus johnsonii。

讨论与结论：讨论指出，该酶辅助细菌–酵母共发酵系统经RSM优化后，多糖和三萜得率高于直接提取，也高于既往超声辅助乳酸菌发酵或延长双歧杆菌发酵等策略。研究人员提出，外源酶预处理主要促进真菌组织破坏和大分子解聚，共发酵则促进更深层生物转化。发酵提取物中多糖相对质量分数下降，研究人员认为可能与微生物裂解核酸、未提取结合复合物及乙酸盐等非碳水化合物共沉淀有关。分子量降低和均一性增加表明多糖发生广泛解聚；岩藻糖降低、甘露糖升高可能与菌株选择性利用岩藻糖富集片段，以及酵母甘露聚糖和微生物胞外多糖共沉淀有关。FT-IR、NMR和SEM结果被视为粗大分子池的初步表征。代谢组学显示lucidenic acid B在直接提取中未检测到，而ganoderic acid C2和oleanolic acid降低，提示微生物生物转化可能参与lucidenic acid形成。微生物蛋白水解和生物转化可能促进鲜味相关氨基酸、肽和核苷酸释放，并降解或转化苦味相关代谢物，从而改善味觉轮廓；但电子舌结果为仪器预测，不等同于人类消费者接受度。体内评价表明，发酵提取物增强促睡眠作用，涉及下丘脑5-HT、GABA、Glu和GABA/Glu平衡，以及增加Lactobacillus、降低Prevotella，可能涉及微生物–肠–脑轴。研究结论翻译为：灵芝子实体经嗜酸乳杆菌和酿酒酵母共发酵后，多糖和三萜得率增加，并显著改变灵芝多糖的理化性质、分子量分布、单糖组成和表面形态；发酵还改变乙醇提取物的小分子谱和味觉属性。在PCPA诱导失眠小鼠中，高剂量发酵提取物比未发酵直接提取物表现出更强的促睡眠活性，表现为睡眠潜伏期缩短、睡眠时间延长、下丘脑神经递质稳态改善、神经元损伤减轻以及肠道微生物多样性和组成改变。这些发现提示，酶辅助细菌–酵母共发酵可能具有开发灵芝促睡眠功能食品的潜力。进一步工作应聚焦于阐明多糖富集级分的精细结构、验证和定量差异候选代谢物，并整合肠道菌群与神经化学分析，以阐明物质基础并探索发酵灵芝促睡眠活性中微生物–肠–脑轴参与的假说。