《Foods》：Differential Regulation of Microbial Community Succession by Bacillus velezensis and Its Impact on Flavor Compound Synthesis During Xiaoqu Baijiu Fermentation Stage
编辑推荐：
为解决小曲白酒（Xiaoqu Baijiu）品质提升的需求，本研究评估了利用先前筛选的促糖化菌株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FUBL1（B1）和FUBL3（B3）进行生物强化发酵（bioaugmented fermentation）
为解决小曲白酒（Xiaoqu Baijiu）品质提升的需求，本研究评估了利用先前筛选的促糖化菌株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）FUBL1（B1）和FUBL3（B3）进行生物强化发酵（bioaugmented fermentation），以阐明其对理化动态、微生物演替和挥发性风味代谢的影响。研究人员采用高通量测序（High-throughput sequencing）、斯皮尔曼相关性分析（Spearman correlation analysis）和风味特征分析（flavor profiling）来追踪发酵动态和跨界微生物互作。结果表明，生物强化显著提高了糖的利用效率。到发酵结束时，酒醅（jiupei）中的总酯含量较对照组分别增加了16.80%（B1）和11.64%（B3）。上调的长链脂肪酸乙酯（如月桂酸乙酯和棕榈酸乙酯）可能有助于增强花香/果香香气品质。从微生物动态角度看，芽孢杆菌（Bacillus）在发酵初期占据主导地位（高达86.24%），并在中后期与片球菌（Pediococcus）共同建立了优势生态位。外源接种在不产生竞争抑制的情况下加速了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生态优势，并增加了如假丝酵母（Candida）等风味相关真菌的相对丰度。斯皮尔曼相关性分析表明，芽孢杆菌的演替与多种核心酯类的富集呈正相关。总之，本研究证明了靶向芽孢杆菌生物强化能够调控微生态动态和风味生物合成，为小曲白酒的品质提升提供了理论基础。
小曲白酒（Xiaoqu Baijiu）作为中国及亚洲极具代表性的传统蒸馏酒，其独特风味源于半固态发酵体系中多菌群驱动的复杂代谢网络，酒醅（jiupei）微生物群落的组成与动态演替是决定最终酒质的关键。然而，现代传统小曲白酒生产常面临发酵周期缩短、微生物代谢网络过度简化等问题，导致核心风味化合物尤其关键酯类丰度不足，产品趋于同质化，严重制约了产业高质量发展。针对这一瓶颈，靶向生物强化（bioaugmentation）通过引入具有高酶活或高产香能力的功能菌株（如芽孢杆菌和酵母）已被证明能有效提升酒质。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）因具有强环境适应性和丰富的胞外酶系统（蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶），在降解大分子底物和生成风味前体方面优势显著。研究人员前期从传统小曲白酒酿造系统中分离到两株具有促糖化能力的B. velezensis菌株FUBL1（B1）和FUBL3（B3），并证实它们在模拟酿造糖化阶段能增强葡糖淀粉酶/淀粉酶活性、促进还原糖生成并刺激特征风味物质释放。但糖化仅是小曲白酒生产的最初环节，后续主发酵阶段才是最终风味质量形成的关键期，而这两株外源菌在后续发酵中的定植稳定性、重塑微生物群落结构的能力以及对挥发性风味合成的影响尚缺乏系统认知。因此，本研究对这些促糖化菌株进行了全程跟踪，综合考察发酵过程中的理化指标动态、微生物群落演替和挥发性代谢物变化，旨在阐明其在主发酵阶段的生态功能与作用机制。
研究人员以糯米为原料，购买自黑龙江禾良农业有限公司，酒曲（Jiuqu）购自湖南永州雅达科技工业有限公司。菌株B1和B3为实验室前期自小曲白酒酒醅中分离所得。实验设置对照组（CK）、B1和B3三个处理组，每组使用一个独立发酵罐，在15 L发酵罐中模拟小曲白酒半固态发酵流程。主要技术方法包括：采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖，手持折光仪测定总可溶性固形物，pH和总酸按文献方法测定；采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）对酒醅中挥发性有机化合物（VOCs）进行分离鉴定，以保留指数（RI）结合质谱库匹配定性，内标法半定量，并计算香气活性值（OAV）；利用16S rRNA基因（V3–V4区）和ITS1区域的高通量测序分析细菌和真菌群落组成，测序平台为Illumina MiSeq PE300，并使用QIIME2 DADA2流程生成扩增子序列变异（ASV），分别以Silva和UNITE数据库进行物种注释；基于Bray–Curtis距离进行主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS），以相似性分析（ANOSIM）检验组间差异；采用斯皮尔曼（Spearman）相关性分析构建关键微生物类群与差异挥发性风味化合物之间的关联网络，并对p值进行Benjamini–Hochberg（BH）校正。
**3.1 发酵过程中理化性质及挥发性风味化合物的动态变化**
**3.1.1 糖含量与酸度的变化**
三组总可溶性固形物从发酵初期（第0天）的20%–22%迅速下降至约8%后趋于稳定，表明可直接利用的大分子碳水化合物基本耗尽。还原糖在第0天达到峰值（7.9–10.3 mg/mL）后因酵母等微生物的消耗而骤降，第5天后低于0.5 mg/mL，其中B3组下降更为明显，说明生物强化有效提高了糖利用效率。总酸度在前3天迅速积累，中后期达到平衡，B1、B3组前3天的总酸均高于CK组，B1组增幅最大；pH在早期快速下降后稳定在3.88–4.88之间，外源菌的添加未显著扰动整体pH轨迹，该酸度调控趋势与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）强化白酒发酵的研究一致。
**3.1.2 酒醅中挥发性风味化合物分析**
在整个发酵过程中共鉴定出221种VOCs，包括87种酯类、43种醇类、12种酸类、15种醛类、21种酮类、8种酚类、18种烷烃和烯烃及17种其他化合物。酯类和醇类始终是主要风味物质类别，且化合物种类随发酵进程递增。生物强化组（B1和B3）在各阶段的挥发性物质种类数均略高于CK组。与CK组相比，发酵结束时B1和B3组的总酯含量分别达到7087.49和6774.70 mg/L，较CK组（6068.05 mg/L）增加了16.80%和11.64%。OAV分析表明多种酯类OAV>1，是贡献果香和花香特征的关键化合物。值得注意的是，B1和B3强化均上调了长链脂肪酸乙酯（LCFAEEs）如月桂酸乙酯、花生酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯的积累，而LCFAEEs对降低白酒刺激性并增强口感“柔和”与“圆润”具有重要作用。此外，生物强化组在发酵后期醇类含量也高于CK组，为酯合成提供了充足前体。B1组在第15天的酚类含量明显低于CK和B3组，表明菌株B1的引入对特定酚代谢微生物类群产生了不同扰动。醛类在CK组中从第5天的102.05 mg/L降至第15天的69.15 mg/L，而B1和B3组始终稳定在51.16–61.67 mg/L的较低水平，这可能反映了醛类还原或参与缩合反应的趋势。
**3.1.3 生物强化组与对照组差异挥发性代谢物比较**
以|log
2FC|≥1且OAV>1为筛选条件，从221种VOCs中筛选出差异挥发性风味化合物。B1与CK组间存在20种差异化合物（11种酯、5种醛、2种酚、2种酸），B3与CK组间存在19种（10种酯、5种醛、2种酸、2种酚）。对照组中，己醛（呈草腥气）和戊酸（短链脂肪酸，呈酸臭气）在整个发酵过程中高水平积累；生物强化组则将这两类不良风味物质抑制至极低水平，这可能有助于提高发酵醪的风味纯净度。LCFAEEs如棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯在对照中积累较低，但在两个强化组中后期显著上调。此外，甜果香酯类如己酸异戊酯和亚油酸乙酯在B1组发酵末期达到峰值；2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（对白酒烟熏香气有重要贡献）在B1和B3组中后期较对照更稳定持续地积累。菌株水平上，B1在整个过程中呈持续积累模式，核心风味化合物在发酵结束（第15天）时达最大值；B3则在早中期表现出旺盛产香能力，关键果香酯类在第10天附近快速合成并达到峰值后略有下降，表明B3具有缩短或优化发酵周期的潜在实用价值。
**3.2 贝莱斯芽孢杆菌生物强化对小曲白酒发酵过程中微生物群落演替的影响**
**3.2.1 高通量测序数据与α多样性**
16S rRNA基因和ITS1测序分别获得2,400,554和2,120,646条高质量序列，平均读长分别为429 bp和413 bp，共鉴定出726个细菌ASV和172个真菌ASV，所有样本Good’s coverage均>99.0%。α多样性分析显示，细菌群落Shannon指数在生物强化组中后期显著高于CK组，表明外源菌的引入打破了CK组中片球菌属（Pediococcus）单属主导的格局，形成了芽孢杆菌属（Bacillus）与片球菌属共存的动态平衡。真菌群落的Chao1和Shannon指数则在生物强化组中显著低于CK组，这归因于贝莱斯芽孢杆菌的胞外酶系统加速底物糖化，为酿酒酵母（Saccharomyces）快速增殖提供了充足碳氮源，从而加速了酿酒酵母优势生态位的建立，并对其余低丰度真菌产生生态排斥。PCoA和NMDS分析显示，生物强化组与CK组的细菌和真菌群落结构均存在显著差异（P=0.001），细菌群落随发酵时间的演替比真菌群落更明显，而真菌群落的总体优势属框架保持相对稳定。
**3.2.2 发酵阶段微生物群落演替**
**细菌群落演替：** 门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）在所有样本中的相对丰度均>99%。CK组整个发酵期间以片球菌属（85.39%–90.36%）和魏斯氏菌属（Weissella，8.37%–12.98%）为主，芽孢杆菌属仅占0.11%–0.28%。接种B. velezensis后，B1组芽孢杆菌属相对丰度在第0天即达到86.24%，随后逐步下降，至发酵结束维持41.52%；片球菌属则从13.03%增至57.90%，中后期两者达到动态平衡。魏斯氏菌属的生态位被芽孢杆菌大量占据，第15天相对丰度降至0.44%（CK为11.70%）。B3组呈现类似格局，由片球菌属（25.60%–51.06%）和芽孢杆菌属（48.04%–73.40%）共同主导。生物强化重塑了细菌群落结构，使芽孢杆菌占据优势生态位。
**真菌群落演替：** 门水平上子囊菌门（Ascomycota）相对丰度>99%。CK组中酿酒酵母属（Saccharomyces）和复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）为主要优势属，酿酒酵母相对丰度从42.56%升至73.00%，复膜孢酵母从55.39%降至25.88%。在B1组中，酿酒酵母相对丰度在第0天即达85.06%，超过CK组峰值（第3天为76.72%），并保持稳定，表明生物强化加速了酿酒酵母优势的确立；假丝酵母属（Candida）相对丰度从0.49%（第0天）升至1.07%（第15天），可能对酯类和高级醇积累有贡献。B3组与B1组优势真菌属组成及演替趋势类似，但群落扰动更为明显，魏斯氏酵母属（Wickerhamomyces）在中期恢复并维持较高丰度。
**3.3 微生物与挥发性风味化合物的相关性分析**
斯皮尔曼相关性分析显示，在CK与B1组比较中，芽孢杆菌属与异戊酸、4-甲基戊酸乙酯呈显著正相关（p<0.01），与2-甲氧基-4-乙烯基苯酚及长链脂肪酸乙酯（肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯）呈正相关，与苯乙醛和辛酸丙酯呈显著负相关；假丝酵母属与肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯等LCFAEEs正相关；乳酸菌（乳杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、片球菌属）与水杨酸甲酯、苯乙醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚及辛酸丙酯呈正相关。在CK与B3组比较中，芽孢杆菌属与异戊酸、4-羟基-3-甲氧基苯乙烯显著正相关，与4-甲基戊酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯、硬脂酸乙酯等酯类正相关，与己醛和苯甲醛显著负相关；非酿酒酵母（假丝酵母属和魏斯氏酵母属）与多种长链酯正相关；而乳酸菌则与己醛、辛醛等醛类正相关，与上述脂肪酸乙酯负相关。这些相关性明确展示了微生物演替与风味化合物积累之间的统计关联。
**讨论与结论**
讨论部分，研究人员指出传统小曲白酒发酵依赖酒曲原生微生物，底物竞争常导致代谢网络同质化。本研究中，外源B. velezensis的引入在细菌层面重塑了群落演替，使芽孢杆菌成为前期优势属，中后期与片球菌共优；在真菌层面，并未损伤酿酒酵母的主导地位，反而同步加速了其优势地位的确立，并提高了风味相关酵母如假丝酵母的丰度。此外，B1与B3菌株虽在细菌演替模式上高度相似，但终期挥发性代谢谱存在菌株特异性差异，可能源于同种内不同菌株在转录调控和胞外酶活性上的细微差异。研究人员提出一个可能的代谢协同机制假设：酿酒酵母对芽孢杆菌产生的脂肽具有内在生理耐受性，同时B. velezensis分泌的胞外酶加速大分子底物降解，为酵母增殖提供充足的碳氮源，这可能同步促进了酿酒酵母快速建群和风味酯积累；外源扰动还可能改变了原位碳通量分配和前体可用性，从而偏向核心风味代谢物的积累。但该研究存在局限性：未直接定量胞外酶活、氨基酸和脂肪酸前体代谢库、代谢通量和绝对微生物丰度，因此上述机制仍是生化层面合理的假说；扩增子测序反映的是相对丰度，基于统计的相关性网络不能证明因果关系；实验室规模发酵与大工业生产的传质、溶氧和热量散失等微生态过程可能存在差异，且风味分析仅限酒醅，未跟踪至最终蒸馏液或进行感官评价。未来需在中小试和工业化条件下，结合定量扩增测序、多组学代谢通量分析及蒸馏试验来完整阐明其机制。研究结论：本研究证明，外源贝莱斯芽孢杆菌B1和B3菌株的生物强化显著改变小曲白酒发酵过程中的微生态结构和挥发性代谢动态。在细菌层面，B. velezensis大幅重塑群落演替，使芽孢杆菌与片球菌在发酵中后期形成共优势生态位；在真菌层面，该转变伴随酿酒酵母及关键功能酵母相对丰度的升高。这些微生态变化与挥发性代谢物富集密切相关。生物强化发酵显著提升了长链脂肪酸乙酯（LCFAEEs）——包括月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯和棕榈酸乙酯——对花香/果香及口感顺滑具有潜在积极贡献。斯皮尔曼共现分析进一步揭示，芽孢杆菌与核心酯类（如4-甲基戊酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕榈酸乙酯和硬脂酸乙酯）呈正相关。总体而言，本研究为利用B. velezensis调控传统半固态蒸馏酒的微生态动态和重塑风味特征提供了一种有前景的策略，为小曲白酒的靶向微生态调控和质量优化奠定了理性理论基础。
