《Foods》：Strain-Dependent Lactic Fermentation Primes Milk Proteins for Gastrointestinal Digestion Under Age-Specific Physiological Conditions
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乳酸发酵通过乳酸菌的蛋白水解活性修饰乳蛋白，可能改变其胃肠消化的敏感性。本研究评估了德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）和瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）单独及共培养发酵对牛乳蛋白结构、后续胃肠消化及残
乳酸发酵通过乳酸菌的蛋白水解活性修饰乳蛋白，可能改变其胃肠消化的敏感性。本研究评估了德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）和瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）单独及共培养发酵对牛乳蛋白结构、后续胃肠消化及残留免疫反应性的影响。研究人员将牛乳分别经德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌或其共培养物发酵，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测酪蛋白（caseins, CNs）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin, βLG）的残留免疫反应性，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估发酵前后及模拟胃肠消化后的蛋白谱，消化模型分别代表1、3、6月龄婴儿及成人的年龄特异性生理条件。结果表明，德氏乳杆菌及共培养发酵分别使ELISA可检测的酪蛋白组分降低7.42%和8.85%，而仅德氏乳杆菌发酵显著降低βLG残留免疫反应性（2.17%）。发酵效应在婴儿消化模型中最为显著，在1月龄和3月龄婴儿模型的胃消化阶段，德氏乳杆菌发酵与酪蛋白和乳清蛋白分子量区域条带的更明显减少相关，而随着消化成熟度的增加，这些差异逐渐减弱。在所有消化模型中，βLG预期分子量范围内的条带始终是胃消化阶段最持久的蛋白条带之一。计算机模拟分析预测了酪蛋白的优先水解、具有潜在生物活性肽段的释放以及乳蛋白间线性致敏表位序列的差异性存留。菌株依赖性乳酸发酵在消化前对乳蛋白进行了部分重塑，进而影响其后续胃肠消化行为。结果表明，发酵效应不仅取决于菌株特异性蛋白修饰，还取决于消化发生的生理条件，为发酵诱导的蛋白重塑与消化成熟度之间的相互作用提供了新见解。
一、研究背景与科学问题
牛乳蛋白具有高营养价值和功能特性，是母乳喂养不可行或不充分时婴儿配方奶粉的主要成分。牛乳蛋白主要包括酪蛋白（caseins, CNs）和乳清蛋白两大类，其中β-乳球蛋白（β-lactoglobulin, βLG）因致密的球状结构（以β-折叠为主并由分子内二硫键稳定）而对胃肠消化表现出高度抵抗性，这种抵抗性在婴儿期更为显著，因为婴儿胃pH较高且胃蛋白酶和胰酶活性低于成人。βLG作为牛乳主要致敏蛋白之一，其消化抵抗性可能导致致敏表位在胃肠转运过程中持续暴露于免疫系统，增加过敏风险。
乳酸发酵是公认的通过乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）蛋白水解活性修饰乳蛋白的生物技术策略。德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）和瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）具备能够将高分子量蛋白水解为肽段和氨基酸的蛋白水解系统。尽管乳酸菌蛋白水解潜力已被广泛研究，但多数研究聚焦于发酵过程中的蛋白水解或生物活性肽释放，关于发酵诱导的结构修饰是否能够持续存在并影响后续不同生理条件下的胃肠消化，尤其是代表不同消化成熟阶段的婴儿期，尚不清楚。本研究假设不同乳杆菌菌株单独及共培养发酵可在消化前部分重塑乳蛋白，从而改变其对胃肠蛋白水解的敏感性和残留免疫反应性，旨在系统评估这一假设。
二、研究设计与技术方法
研究人员采用多种关键方法开展研究。通过16S rRNA基因测序对菌株进行分子鉴定，确认德氏乳杆菌和瑞士乳杆菌的种属身份。采用脱脂乳粉复水制备标准化乳基质，以非发酵乳为对照，分别用德氏乳杆菌（LD）、瑞士乳杆菌（LH）及二者共培养（LD+LH）在37°C下发酵14小时，监测pH、可滴定酸度、乳酸菌活菌数和可溶性蛋白浓度。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）评估发酵前后及消化各阶段的蛋白谱变化，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测酪蛋白和βLG的残留免疫反应性。体外胃肠消化采用代表1、3、6月龄婴儿及成人的年龄特异性生理模型，依次进行胃相和肠相消化。此外，利用BIOPEP-UWM数据库进行计算机模拟（in silico）水解分析，以乳酸菌细胞包膜丝氨酸内肽酶lactocepin（EC 3.4.21.96）为水解模型，预测水解度、释放肽段的潜在生物活性及残留线性致敏表位序列。
三、研究结果
3.1 菌株分子鉴定与发酵性能
16S rRNA基因测序确认菌株分别为德氏乳杆菌和瑞士乳杆菌，与NCBI GenBank参考菌株的序列相似性分别为99.20%和99.29%，查询覆盖率均为100%。发酵过程中，所有发酵样品的pH均显著下降，其中LD的pH降幅最大（21.80%），其次为共培养（18.30%）和LH（6.81%）。可滴定酸度呈相反趋势，LD在14小时时表现出最高的酸化能力。各处理间乳酸菌活菌数无显著差异，均从初始约5 log CFU/mL增至约8 log CFU/mL。可溶性蛋白浓度在整个发酵过程中各处理间无显著差异，表明蛋白水解程度有限，未显著改变总可溶性蛋白组分。
3.2 发酵后乳蛋白结构修饰与残留免疫反应性
SDS-PAGE分析显示，主要蛋白组分在发酵后基本保持完整，但LD和共培养样品在约15–20 kDa区域出现额外条带，提示发酵过程中形成了中间蛋白片段。ELISA检测显示，LD和共培养分别使ELISA可检测的酪蛋白组分降低7.42%和8.85%，仅LD显著降低βLG残留免疫反应性（2.17%）。酪蛋白因其内在无序的磷酸化蛋白结构而更易被微生物蛋白酶水解，而βLG的致密球状构象限制了酶的可及性。这些结果表明发酵促进了局部结构重塑而非广泛蛋白降解。
3.3 年龄特异性体外胃肠消化下的蛋白消化谱
在1月龄和3月龄婴儿消化模型的胃相阶段，LD发酵乳中酪蛋白和乳清蛋白分子量区域的条带减少更为明显，表明发酵增加了乳蛋白对胃蛋白酶的敏感性。随着消化成熟度增加（6月龄模型），各处理间的差异逐渐减小，内源性胃蛋白水解逐渐成为蛋白水解的主导因素。在成人消化模型中，尽管胃蛋白水解能力更强，酪蛋白相关条带在胃相后仍可检测到，且各处理间差异较婴儿模型更不明显。在所有消化模型中，βLG分子量范围内的条带始终是胃消化阶段最持久的蛋白条带之一，确认了其固有的胃蛋白酶抵抗性。肠相消化后，所有处理的蛋白条带均显著减少，胰酶水解成为主导因素，发酵处理间的差异基本消失。
3.4 计算机模拟水解预测
BIOPEP-UWM模拟显示，lactocepin水解的理论水解度（DHt）范围为43.07%至69.50%，其中β-酪蛋白最高（69.50%），其次为κ-酪蛋白（57.14%）、αS1-酪蛋白（53.05%）、βLG（51.91%）、αS2-酪蛋白（46.61%），而牛血清白蛋白（BSA）（43.07%）和α-乳白蛋白（αLA）（43.26%）最低。所有七种乳蛋白均预测可释放具有潜在生物活性的肽段，其中β-酪蛋白产生最多样化的预测生物活性（n=14），其次为αLA（n=13）。模拟预测β-酪蛋白、αS1-酪蛋白和αS2-酪蛋白在lactocepin水解后无残留线性致敏表位序列，而κ-酪蛋白、βLG、αLA和BSA存在残留表位，包括IRCEKDERFF（κ-酪蛋白，残基30–39）、KKIIAEKTKI（βLG，残基85–94）、INNKIWCKDD（αLA，残基74–83）以及BSA来源的两个表位。
四、讨论与结论
研究结果表明，发酵效应不仅取决于菌株特异性蛋白修饰，还取决于消化发生的生理条件。在婴儿生理条件下，由于内源性蛋白水解能力有限，发酵诱导的结构修饰效应更为显著；随着消化能力增强，这些差异逐渐减弱，消化谱逐渐由消化酶的生理作用决定。计算机模拟结果与实验观察定性一致，预测了酪蛋白的优先水解和生物活性肽的释放，同时提示线性致敏表位的存留取决于酶切是否发生在这些序列内部或邻近位置。然而，模拟结果仅为理论预测，未考虑蛋白三维构象和发酵过程中的构象变化，实际水解程度可能低于预测值，βLG仅表现出适度的免疫反应性降低即为佐证。
研究结论指出，德氏乳杆菌和瑞士乳杆菌在发酵过程中表现出不同的酸化模式和蛋白修饰特征。德氏乳杆菌酸化能力最强，且是唯一显著降低βLG残留免疫反应性的处理，而德氏乳杆菌和共培养均降低了ELISA可检测的酪蛋白组分，但降幅有限。这些发酵诱导的修饰与乳蛋白胃消化敏感性的增加相关，尤其在代表婴儿早期的生理条件下最为明显，而随着消化成熟度增加其影响逐渐减弱。尽管发酵单独作用仅产生适度的免疫反应性降低，但它改变了乳蛋白后续的消化行为，特别是在婴儿生理条件下。这些发现为理解发酵诱导的蛋白修饰与消化成熟度之间的相互作用提供了基础，但需进一步研究确认这些分子修饰是否转化为临床上的致敏性降低和可测量的生物学效益。研究结论应在该研究采用的加工复水乳基质体系背景下进行解读。
