基于研究分组预测毒理学的聚苯乙烯微纳塑料体外细胞毒性：几何衍生给药剂量指标与纳米尺度限制敏感性分析

《Polymers》：Study-Grouped Predictive Toxicology of In Vitro Polystyrene Micro- and Nanoplastic Cytotoxicity: Geometry-Derived Administered-Dose Metrics and a Nanoscale-Restricted Sensitivity Analysis

　　

聚苯乙烯（Polystyrene, PS）微塑料与纳米塑料在不同颗粒特征和暴露条件下表现出异质性的体外细胞毒性。研究考察了几何衍生的给药剂量指标能否改善体外细胞毒性的研究外预测能力，以及将粒径限制在≤100 nm是否能在独立于研究组成的情况下改善预测性能。在来自98项哺乳动物体外研究的2443条文献来源观察数据中，1701条来自82项研究的观察数据构成主要质量浓度数据集，995条来自60项研究的观察数据构成≤100 nm子集。研究采用嵌套研究分组交叉验证（nested study-grouped cross-validation）结合逆研究频率权重对随机森林（Random Forest, RF）模型进行评估。由六项研究的141条观察数据构成的匹配数据集支持留一文章交叉验证（leave-one-article-out, LOAO）比较质量浓度、颗粒数浓度和几何表面积浓度三种剂量指标。在纳米尺度子集中，观察水平平均绝对误差（Mean Absolute Error, MAE）从15.36个百分点降至14.37个百分点，R2从0.283提升至0.447，而研究平衡平均绝对误差未获改善（15.37对15.60）。在组成受控的22项研究分析中，以相同的纳米尺度测试观察数据评估，仅纳米尺度训练未显示出明显优势。岭回归（Ridge regression）倾向于质量浓度指标，而随机森林显示出微小且不确定的颗粒数优势。几何衍生给药剂量指标未提供一致的模型无关优势。研究平均R2（0.095）表明泛化能力有限。质量浓度在当前证据基础内仍是实用参考指标；需要标准化报告，且几何衍生指标反映的是给药剂量而非递送剂量。

研究背景与问题

微米和纳米尺度塑料颗粒作为一类特殊的聚合物材料，其生物学行为受聚合物身份、颗粒几何形态、表面化学性质、分散状态以及细胞接触条件等多重因素共同塑造。聚苯乙烯（Polystyrene, PS）因具备可控尺寸、表面化学修饰和荧光标记的商品化颗粒，成为微纳塑料实验研究中最广泛使用的模型聚合物。体外研究已报道PS颗粒暴露可导致细胞代谢活性改变、膜完整性损伤、氧化平衡失调、炎症信号激活、基因组稳定性受损及细胞存活率下降等多种效应。然而，跨研究解读面临重大困难，因为实验设计在细胞模型、检测平台、暴露时长、血清条件、颗粒表征和给药剂量等方面存在显著差异。

剂量表示是这种不可比性的主要来源之一。体外颗粒毒理学中，暴露通常以名义质量浓度（nominal mass concentration）表示，常用单位为μg/mL或mg/L。虽然实验操作便捷，但质量浓度无法保留区分不同尺寸颗粒的几何信息。在相同质量浓度下，由较小球形颗粒组成的悬浮液含有显著更多的颗粒数量，并呈现更大的总几何表面积。颗粒数约与直径的立方成反比，而单位质量的几何表面积约与直径成反比。因此，相同的名义质量浓度可能代表截然不同的颗粒负荷。颗粒尺寸和表面性质影响细胞摄取、膜相互作用、蛋白质吸附、细胞内运输和生物学响应，这一区别对纳米塑料毒理学尤为重要。

颗粒数浓度和几何表面积浓度提供了替代剂量表示方式，保留了纯质量描述中丢失的物理信息。然而，这些指标不应被解释为递送细胞剂量的直接度量。到达细胞界面的给药悬浮液比例还取决于团聚状态、有效密度、扩散、沉降、培养基组成和粘度、液柱高度、暴露时长和培养几何条件。因此，几何衍生指标在理想化几何假设下描述名义给药颗粒悬浮液，并不重建颗粒向细胞表面的运输、沉积或摄取。这一限制在文献衍生分析中尤为重要，因为初级直径、密度、分散状态和暴露几何的报告不一致。此外，初级几何直径不应等同于流体动力学直径或暴露介质中占主导的团聚体尺寸。

在聚合物表征与预测毒理学的交叉领域，文献衍生建模为检验物理化学颗粒描述符和暴露条件能否在独立实验中编码可复现的细胞毒性响应模式提供了补充框架。机器学习与统计模型可整合多维实验观察，检验超越个别研究条件的暴露-响应关系是否仍然可检测。然而，预测效度关键取决于保持研究水平独立性。由于单篇文献可能贡献多个相关的剂量水平、暴露时长、颗粒配方和实验条件，随机逐行训练-测试划分可能对未见研究产生乐观的性能估计。剂量表示之间的比较同样如此。若质量、颗粒数和表面积模型因几何表征选择性缺失而在不同实验观察上训练，表面上的性能差异可能反映数据集组成变化而非剂量指标本身的差异。因此，可靠的比较需要匹配观察、文章分组验证，并明确考虑从报告不完整的颗粒性质推导几何剂量描述符所引入的不确定性。

验证策略本身并不能解决模型适用域内的异质性。1–1000 nm的操作性粒径域跨越了广泛的物理化学范围。在此区间内，颗粒在固定质量所代表的数目、可用总表面积、扩散和沉降行为、细胞接触机制和潜在内化途径方面差异显著。接近该域上边界与严格纳米尺度（约100 nm）范围的颗粒之间的区分既具有定义性也具有生物学意义。因此，跨越此域的模型可能遭遇异质性暴露-响应关系，但将分析限制在≤100 nm后观察到的任何改进也可能反映贡献研究的变化。在将预测性能差异归因于更强的纳米尺度一致性之前，必须区分粒径限制与研究组成效应。

研究目的与设计

针对上述背景，研究聚焦两个相关但分析上不同的不确定性。第一，在相同实验观察上评估替代剂量指标时，用几何衍生颗粒数或几何表面积浓度替代名义质量浓度是否能提供可复现的研究外预测改进。第二，在贡献研究和留出纳米尺度观察保持可比时，≤100 nm限制后的表观预测性能差异是否仍然存在。这些问题很重要，因为未明确考虑研究水平聚类、数据集组成和适用域时，较高的表观模型性能并不必然表示更好的生物学表征。

研究人员开发了文献衍生、研究分组的哺乳动物体外PS颗粒细胞毒性预测毒理学框架，将聚合物颗粒尺寸和几何形态作为模型适用域的明确组成部分。首先，在协调质量浓度数据集中评估跨研究预测归一化活力相关响应，并在预设的≤100 nm纳米尺度限制子集中检验预测性能。其次，在质量浓度、颗粒数浓度和几何表面积浓度均可表示的实验观察中，进行匹配比较，评估几何衍生给药剂量指标是否比常规质量浓度提供更一致的研究外预测。此外，还进行了组成受控敏感性分析，比较广域和仅纳米尺度训练在来自同时贡献两种粒径范围研究的相同留出纳米尺度观察上的表现。所有验证程序均按文章分组，确保同一出版物来源的观察不能同时贡献于模型开发和留出评估。

主要技术方法

研究采用系统证据识别策略，检索PubMed/MEDLINE、Web of Science Core Collection和Scopus数据库至2026年9月13日，覆盖PS纳米塑料、传统PS乳胶/珠/微球及缩写安全网三个互补分支，结合暴露与活力/细胞毒性相关术语。数据在单个实验条件水平提取，每个观察分配唯一Observation_ID并关联Article_ID和Particle_Arm_ID。提取变量包括出版年份、细胞模型、组织来源、检测方法、暴露时长、报告剂量和单位、初级颗粒直径、颗粒形态、表面功能化、流体动力学直径、zeta电位、多分散指数、分散程序、血清浓度、颗粒来源、材料密度及密度来源、归一化活力相关响应、方差报告、重复信息和检测干扰信息。连续结果变量为归一化活力或存活相关响应，以对应未处理对照的百分比表示。图数字化构成提取过程的主要组成部分，1701条主要质量浓度数据集观察中1641条（96.5%）为图衍生，60条（3.5%）为直接数值报告。质量评估采用SciRAPnano体外工具v2.0信息域，报告质量和方法学质量作为独立构念处理。

预测建模采用嵌套分组交叉验证框架。所有重采样程序按Article_ID分组观察，防止同一出版物的观察同时贡献于模型开发和留出评估。由于各研究提取的实验条件数量差异大，模型拟合使用逆研究频率样本权重，每篇文章中每个观察的拟合权重与1/n_i成正比。初始基准分析比较中位数哑变量回归器、岭回归、随机森林、极端随机树和CatBoost梯度提升。最终非线性分析使用五折外层GroupKFold用于性能估计，三折内层分组折用于模型选择，内外分组划分均启用洗牌并固定随机种子42。随机森林调优限制在四个预设的最小叶大小和最大特征分数组合。连续预测因子使用训练折中位数插补，分类预测因子使用训练折中最频繁类别插补并独热编码。性能不确定性通过1000次Article_ID聚类自助法复制量化。匹配几何衍生剂量指标比较使用留一文章交叉验证，岭回归正则化强度在训练集内通过三折分组交叉验证选择。配对对比定义为MAE(mass) ? MAE(alternative)，95%置信区间通过5000次文章聚类自助法复制估计。

研究结果

证据基础与最终分析数据集。 数据库检索识别4649条记录，去除2149条重复后，2500条记录进行标题和摘要筛选，1724条在此阶段排除。776条记录进入全文检索，成功获取并评估153篇全文，其中98项研究满足最终纳入标准，55篇在全文审查后排除。最终冻结提取档案包含227个颗粒臂和2443条条件水平观察。主要质量浓度数据集包含来自82项独立研究的1701条非零暴露观察。中位数给药质量浓度为50 μg/mL（四分位距10–125；范围0.1–5000），中位数暴露时长为24小时（四分位距10–24；范围0.333–672），中位数归一化响应为96.0%（四分位距82.0–102.0；范围0–193.3）。1629条观察具有数值初级几何直径，中位数为100 nm（四分位距50–200），72条观察（4.2%）缺乏数值初级几何直径。人类细胞系统占1422条观察（83.6%）。预设严格≤100 nm数据集包含来自60项独立研究的995条观察。度量可比数据集包含来自六项独立研究的141条观察，所有几何转换均满足预设高剂量转换置信标准。

基准模型性能。 在研究分组折外基准评估下，中位数哑变量基线产生MAE 17.16个百分点、RMSE 27.45、R² ?0.071。学习模型中，CatBoost实现最低观察水平MAE（14.68）、最低RMSE（21.38）和最高观察水平R²（0.350），而随机森林实现最低研究平衡MAE（15.42）。由于预设模型选择策略优先考虑研究平衡绝对误差同时兼顾观察水平预测性能，随机森林被推进至嵌套分组分析。

嵌套分组随机森林与严格≤100 nm敏感性分析。 在完整主要质量浓度数据集中，最终嵌套研究分组随机森林产生MAE 15.36个百分点（95%文章聚类自助法置信区间12.78–19.41）、RMSE 22.46（17.94–28.42）、R² 0.283（0.033–0.461）。相应研究平衡MAE为15.37，研究平均R²为0.095，表明按未见源研究水平汇总时预测仍然有限。在预设≤100 nm子集中，最终嵌套研究分组随机森林产生MAE 14.37个百分点（95%置信区间12.30–17.07）、RMSE 21.23（18.48–24.67）、R² 0.447（0.281–0.556）。相应研究平衡MAE为15.60，研究平均R²为0.322。在同一嵌套研究分组验证框架下，限制至≤100 nm与较高观察水平和研究平均R²及略低观察水平MAE和RMSE相关，但未与较低研究平衡MAE相关。由于≤100 nm限制改变了贡献研究的组成，此比较被解释为预设敏感性分析而非预测优越性的配对检验。在22项同时贡献≤100 nm阈值两侧观察的研究组成的额外事后敏感性分析中，使用来自这些共享研究的相同留出≤100 nm观察，广域和仅纳米尺度训练未显示纳米尺度限制模型的明确预测优势。广域和仅纳米尺度训练在447条相同留出纳米尺度观察上分别产生观察水平MAE 19.83和19.77、R² 0.292和0.274、研究平衡MAE 19.70和20.61。此结果表明完整≤100 nm子集中更有利的观察水平表现不应被解释为将训练域限制至≤100 nm必然改善研究外预测的独立证据。留出置换重要性显示，置换给药剂量产生最大MAE增加（ΔMAE 4.78个百分点），其次为协调表面电荷组（ΔMAE 4.06）和初级颗粒直径（ΔMAE 2.47），表面功能化组贡献较小（ΔMAE 0.41）。

匹配质量、颗粒数和几何表面积剂量指标比较。 在匹配几何可比数据集中，三种剂量表示的相对性能因模型类别而异。在留一文章交叉验证岭回归下，质量浓度产生最低研究平衡MAE（11.68），颗粒数为15.02，几何表面积为14.22；相应观察水平MAE分别为7.52、13.10和12.89。在随机森林比较器中，颗粒数产生最低研究平衡MAE（9.80），质量浓度为10.30，几何表面积为11.29。随机森林比较的配对研究平衡对比中，颗粒数ΔMAE（质量?颗粒数）= 0.50个百分点（95%文章聚类自助法置信区间?1.87至2.87），几何表面积相应对比为?0.99个百分点（?3.00至0.50）。表观颗粒数优势的置信区间包含零，表明差异方向存在大量不确定性。由于岭回归倾向于质量浓度而随机森林仅显示微小且不确定的颗粒数优势，没有几何衍生给药剂量表示证明一致的模型无关质量浓度改进。额外事后岭回归敏感性分析中，仅质量基线产生观察水平MAE 7.93和研究平衡MAE 10.98。单独添加初级颗粒直径产生观察水平MAE 7.87和研究平衡MAE 11.03，而同时包含直径和质量-直径交互产生相应值7.34和10.43。仅质量与交互模型之间的配对研究平衡MAE差异为0.55个百分点（95%置信区间?0.73至2.13），未提供跨研究一致改进的明确证据。交互模型在六项贡献研究中的三项降低MAE，在其余三项增加MAE。

额外稳健性分析。 直接报告子集包含来自19项研究的60条观察，产生MAE 20.68、R² ?0.419和研究平衡MAE 18.89。检测干扰控制子集包含来自30项研究的628条观察，产生MAE 20.72、R² 0.111和研究平衡MAE 20.19。两种限制均减少贡献研究数量并改变分析数据集组成，因此被解释为域限制诊断而非与完整主要数据集的直接性能比较。排除72条缺乏数值初级颗粒直径的观察产生1629条来自78项研究的完整案例数据集，MAE 15.55、R² 0.310、研究平衡MAE 15.67。从预测因子集移除原始检测和颗粒尺寸类别保留1701条来自82项研究的观察，产生MAE 15.58、R² 0.236、研究平衡MAE 15.77。限制至报告和方法学质量均分类为高的研究保留1575条来自70项研究的观察，产生MAE 15.42、R² 0.270、研究平衡MAE 15.55。额外盲法人工再提取评估检查了来自十篇源文章的30个选定图衍生实验条件，23个条件可独立恢复数值，七个无法可靠量化。23个可读比较中，平均绝对差异为1.43个百分点（中位数0.90；RMSE 2.45），20个值（87.0%）差异不超过两个百分点。

讨论与结论

研究产生两个互补发现。第一，限制至预设≤100 nm域与较高观察水平和研究平均R²及略低观察水平预测误差相关，但研究平衡MAE未改善。第二，在匹配几何可比数据集中，用几何衍生颗粒数或几何表面积浓度替代名义质量浓度未提供跨模型类别的一致预测优势。这些发现共同表明，与纳米尺度限制相关的表观预测收益需要考虑研究组成，而仅改变给药剂量表示不提供模型无关优势。

≤100 nm分析中观察到的较高研究外R²和略低观察水平误差不应被解释为较小PS颗粒本质上更具毒性的证据。纳米尺度子集在粒径范围和贡献研究组成两方面均不同于更广数据集。在限制于22项贡献≤100 nm阈值两侧观察的研究的事后分析中，仅纳米尺度训练未改善研究平衡MAE（20.61对19.70）或R²（0.274对0.292），相应配对不确定性区间包含零。粒径依赖性异质性在生物学上仍然合理，因为颗粒尺寸影响细胞摄取途径、膜相互作用、蛋白质吸附、细胞内运输、扩散和沉降行为以及固定质量剂量所代表的颗粒数和总表面积。然而，组成受控结果并未确立将训练域限制至≤100 nm可独立于所代表研究改善预测。

几何衍生给药剂量分析解决了相关但分析上不同的颗粒表征和剂量学问题。颗粒数和几何表面积指标在机制上具有吸引力，因为它们保留了质量单独无法捕获的几何信息。然而，仅六项独立研究提供了足够表征以在相同实验观察上比较所有三种剂量表示。在此受限匹配数据集中，岭回归倾向于质量浓度，而随机森林比较器仅显示微小颗粒数优势，相应配对文章聚类自助法区间跨越零。剂量指标的相对排序因此是模型依赖的而非跨模型类别可复现的。此外，几何衍生给药剂量计算依赖于报告初级直径、形态和材料密度，同时仍区别于递送细胞剂量，后者额外取决于团聚、有效密度、介质性质、液柱高度、扩散、沉降和暴露几何。

研究还识别了聚合物科学与微纳塑料毒理学交叉处的颗粒表征瓶颈：改善剂量表示不仅需要替代指标，还需要足够完整的聚合物颗粒性质和暴露条件报告。几何衍生指标在推导所需的颗粒表征不可用或报告不完整时无法可靠计算或一致比较。当前发现并未确立几何衍生指标应在现有有限证据基础下替代质量浓度作为实用跨研究参考。相反，质量浓度应与颗粒尺寸、形态、密度和表面特征一起解读，而几何衍生指标在所需物理化学信息可用时仍为有价值的次要表示。

研究分组验证设计对预测性能的解读至关重要。文献衍生毒理学数据集经常包含来自同一出版物的多个剂量水平、暴露时长、颗粒配方和细胞条件。随机逐行划分可能将紧密相关的观察置于训练和测试集中，产生部分反映研究内相似性而非向独立研究可转移性的性能估计。通过在每个重采样阶段按Article_ID分组并应用逆研究频率拟合权重，该框架评估了从一组出版物学到的暴露-响应关系是否泛化至先前未见研究。行级观察数与独立贡献研究数之间的差异说明了为什么研究水平分离在文献衍生预测毒理学中尤为重要。尽管主要模型观察水平R²为0.283，研究平均R²仅为0.095，表明解释跨留出研究平均响应差异的能力有限。模型不应被视为为任意新实验设置提供可靠定量预测。

稳健性分析进一步强调了研究组成的重要性。直接报告数值结果仅占证据基础的一小部分，限制至这些观察产生较差的组预测性能（R² = ?0.419；60条观察来自19项研究）。同样，限制至报告检测干扰控制研究的观察未产生更强研究外预测。这些发现不应被解释为直接报告或更好控制实验信息量较少或方法学质量较低的证据。两种限制均大幅减少贡献研究数量并改变分析域，因此被视为域限制诊断而非直接质量比较。额外事后分析提供了类似谨慎理由。排除72条缺失初级直径的观察产生MAE 15.55，而主要模型为15.36，尽管贡献研究不同。移除潜在冗余检测和颗粒尺寸预测因子产生MAE 15.58和R² 0.236，而限制至报告和方法学质量均高的研究产生MAE 15.42和R² 0.270。这些分析未识别跨性能测量的一致改进，且不消除缺失、预测因子依赖或研究质量的可能影响。

更广泛地，研究突出了聚合物表征与毒理学交叉处的报告挑战。图衍生观察占主要建模数据集的96.5%，表明条件水平数值数据很少以直接可重用形式提供。虽然图数字化实现了更大证据基础的恢复，但必然引入额外测量不确定性并限制方差信息恢复。额外盲法人工再提取评估检查了30个选定图衍生条件，其中23个产生独立可读数值，七个无法可靠量化。23个可读比较中，平均绝对差异为1.43个百分点，20个值差异不超过两个百分点。此有限评估无法确立完整图衍生数据集的提取准确性，特别是在条件分配或归一化仍不确定的情况下。更广泛文献同样识别不完整和异质性暴露报告为定量综合和风险相关解读的主要障碍。

研究还存在若干额外限制。第一，623条全文候选池记录在工作流关闭前无法检索，最终证据基础不应被视为详尽。第二，高比例图衍生观察引入提取不确定性，尽管有明确来源编码和预设数字化质量控制。第三，几何可比分析包含141条匹配观察但仅六项独立研究，行级信息量大幅超过支持指标间推断的独立单元数。第四，模型代表给药而非递送细胞剂量，限制从受控实验室暴露到人类或环境现实暴露场景的直接转化。第五，细胞系统、检测平台、血清条件、暴露时长和颗粒制备间仍存在残余异质性。最后，研究提供跨独立出版物的研究分组内部验证而非前瞻性设计外部实验队列中的验证。

这些限制被若干方法学优势所平衡。分析基于冻结条件水平提取档案，维持质量浓度、给药面积剂量和几何衍生给药剂量指标之间的严格区分，保留源报告高于100%的响应，避免不支持的伪对照、中间剂量和单位转换。模型开发和性能估计通过嵌套研究分组验证分离，逆研究频率加权和研究平衡性能测量减少贡献不成比例大量观察文章的影响。纳米尺度分析为预设，剂量指标比较在相同实验观察而非独立过滤数据集上进行。额外事后分析检查研究组成效应、替代岭回归规范、缺失直径信息、预测因子冗余和研究质量而不替换原始主要分析。这些设计选择刻意偏向可转移性的保守估计而非最大化表观预测性能。由此产生的框架为检查聚合物颗粒性质-暴露-响应关系提供了可复现的数据驱动方法，同时明确尊重研究聚类、报告异质性和适用域约束。使用标准化颗粒面板、测量介质内颗粒行为、协调活力检测和公开条件水平数据的前瞻性多实验室实验对于确立观察关系是否泛化至新实验系统以及替代给药剂量指标是否提供可复现预测收益是必要的。

结论翻译。 在此文献衍生的哺乳动物体外PS细胞毒性数据分析中，预设纳米尺度限制子集（≤100 nm）显示比更广1–1000 nm分析更高的观察水平和研究平均R²，以及略低的观察水平MAE和RMSE。全域模型产生R² 0.283和研究平均R² 0.095，而纳米尺度限制模型在嵌套研究分组验证下产生R² 0.447和研究平均R² 0.322。然而，研究平衡MAE在主要数据集中为15.37，在严格子集中为15.60，表明限制至更窄粒径域未改善所有预测误差测量。全域模型中低研究平均R²也表明独立研究水平预测性能有限。此外，涉及22项贡献两种粒径范围研究的事后组成受控分析显示，在相同留出≤100 nm观察上评估时，仅纳米尺度训练无明确优势。预设纳米尺度子集中的表观改进因此不能自信地归因于独立于研究组成的粒径限制。

几何衍生给药剂量指标保留了质量浓度单独无法代表的物理化学信息，但当前六研究匹配证据基础未证明颗粒数或几何表面积浓度对质量浓度的一致预测优势。对于PS微纳塑料细胞毒性的跨研究建模，质量浓度因此在当前证据基础内仍是实用参考指标，前提是它与颗粒尺寸和表面特征一起解读且模型验证保持研究水平独立性。此实用角色不应被解释为质量浓度本质上是最生物学相关剂量指标的证据。此外，几何衍生指标描述给药剂量而非递送细胞剂量。更完整和标准化的条件水平活力结果、初级颗粒尺寸和形态、材料密度、表面功能化和电荷以及暴露描述符报告对于确定几何衍生给药剂量指标能否提供可复现跨研究预测收益至关重要。更广泛地，结果支持将粒径域定义和聚合物颗粒表征视为数据分析的核心组成部分而非次要报告细节。具有标准化颗粒表征和暴露条件的前瞻性跨实验室验证对于确立这些发现的泛化性是必要的。