含1,2,4-三唑苯磺酸酯衍生物的合成、生物评价及分子动力学研究：作为潜在酶抑制剂及其对HepG2细胞的细胞毒性

《Pharmaceuticals》：Synthesis, Biological Evaluation, and Molecular Dynamics Studies of Novel 1,2,4-Triazole-Functionalized Benzene-Sulfonate Derivatives as Potential Enzyme Inhibitors and Cytotoxicity in HepG2 Cells

　　

中文摘要翻译 背景/目的： 本研究合成了含有1,2,4-三唑环的新型苯磺酸酯衍生物。方法： 通过红外光谱（IR）、1H NMR和13C NMR波谱学分析，结合Q-TOF LC/MS分析对其分子结构进行了表征。对于化合物5b和5d，可用的质谱数据未用于结构确认，其结构归属主要基于波谱学数据。研究人员评估了所合成化合物（3–5）对乙酰胆碱酯酶（AChE）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）的抑制效应。结果： 与参考抑制剂多奈哌齐（donepezil）和依他尼酸（ethacrynic acid）的比较结果显示，化合物3e在所测试化合物中表现出最高的AChE抑制活性，IC50值为1.60 ± 0.198 μM。此外，化合物4a表现出显著的GST抑制活性，IC50值为1.95 ± 0.492 μM，其效力优于参考抑制剂。所选化合物的细胞毒性效应在24 h和48 h处理后进一步针对HepG2细胞系进行评估。总体而言，所合成的分子表现出强效的酶抑制活性以及良好的细胞毒性效应，凸显了其作为候选先导化合物用于进一步生物学研究的潜力。研究人员进行了计算机模拟分析，以阐明所合成衍生物实验观察到的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性的分子基础。针对人AChE（PDB ID：4EY7）的分子对接分析确定化合物3e为所合成系列中结合最有利的化合物，而3f也表现出较强的结合特性。随后对hAChE–3e、hAChE–3f和hAChE–多奈哌齐复合物进行的100 ns分子动力学模拟表明，蛋白质构象稳定，配体在催化峡谷内持续容纳。MM/GBSA计算进一步表明，3e的结合能谱比3f更有利，而多奈哌齐显示出总体最优的计算结合能。逐残基分解分析突出了关键峡谷残基，包括Trp86、Trp286、Tyr337、Tyr341、Phe295和Phe297，是配体稳定的重要贡献者。结论： 综合来看，这些计算发现为先导衍生物实验观察到的AChE抑制活性提供了结构和能量学支持。

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一、研究背景与科学问题

含氮杂环化合物，尤其是1,2,4-三唑衍生物，因其在药物化学、农业应用、材料开发和有机合成中的广泛用途而受到极大关注。三唑环能够与生物靶标建立氢键和偶极–偶极相互作用，从而促进分子识别和生物活性。已有多种上市药物（如氟康唑、氟丙氧唑和阿那曲唑）含有该杂环骨架。既往研究表明，含1,2,4-三唑环的分子表现出显著的抗炎、抗癌、抗高血压、抗菌和抗惊厥等活性。尽管已有大量此类化合物被报道，但由于其广谱生物活性、低毒性和良好的药代动力学特性，合成带有不同取代基的新型类似物仍是活跃的研究领域。

苯磺酸酯类化合物是最常用的离去基团之一，含磺酸酯基团的分子已被报道具有增强的细胞内活性，并具有优异的抗肿瘤、抗凝血和抗菌性能。席夫碱（Schiff base）化合物因含有甲亚胺（–CH=N–）键而具有广泛的药理学潜力，包括抗菌、抗真菌、抗癌、抗HIV、抗结核、抗病毒、抗炎、抗惊厥和抗疟疾等活性。

在疾病靶标方面，乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）是神经退行性疾病（尤其是阿尔茨海默病）中研究最深入的酶之一。根据胆碱能假说，药理学抑制AChE可延长突触间隙中乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）的可用性，从而部分恢复神经传递并改善认知功能。此外，AChE还通过其外周阴离子位点（peripheral anionic site，PAS）促进淀粉样蛋白-β（amyloid-β，Aβ）纤维形成，参与AD病理过程。因此，开发能够同时靶向催化活性位点和PAS的多功能AChE抑制剂成为有吸引力的治疗策略。

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases，GSTs）是参与细胞防御氧化和亲电应激的II相解毒酶家族。虽然这一保护机制在生理条件下对维持细胞稳态至关重要，但在包括肝细胞癌在内的多种恶性肿瘤中，GST同工酶的异常过表达与抗癌药物解毒增强、化疗耐药、肿瘤进展和不良临床结局相关。抑制HepG2细胞中的GST活性可破坏细胞内氧化还原稳态，促进活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，损害线粒体功能，最终触发凋亡性细胞死亡。因此，选择性GST抑制代表了一种使肿瘤细胞对氧化损伤敏感并提高抗癌药物疗效的有前景策略。

基于上述背景，本研究旨在合成一系列含有1,2,4-三唑–席夫碱片段的苯磺酸酯衍生物，通过在对位引入不同取代基（供电子基p-OCH₃和吸电子基p-F、p-Cl、p-Br、p-I、p-NO₂）系统研究构效关系（structure-activity relationship，SAR），并评估其AChE和GST抑制活性及对HepG2细胞的细胞毒性。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过无溶剂缩合反应，将4-甲酰基苯基4-取代苯磺酸酯（1）与4-氨基-5-取代-3H-1,2,4-三唑-3-酮（2）在160–170 °C油浴中加热1 h，经DMF/水（1:3，v/v）重结晶纯化，以80.80%–92.15%的良好至优异产率获得了目标化合物（3–5），共21个衍生物（3a–3g、4a–4g、5a–5g）。所有化合物通过FT-IR、¹H NMR、¹³C NMR和LC-Q-TOF-MS进行了结构表征。

酶抑制活性评估显示，所合成化合物对AChE的IC₅₀值范围为1.60 ± 0.198至3.00 ± 0.912 μM，参考抑制剂多奈哌齐（donepezil，DNP）的IC₅₀值为0.202 ± 0.031 μM。其中化合物3e表现出最高的AChE抑制活性（IC₅₀ = 1.60 ± 0.198 μM），4e（1.74 ± 0.765 μM）、3f（1.92 ± 0.291 μM）、4g（1.96 ± 0.134 μM）和5d（1.96 ± 0.475 μM）也表现出相对较强的抑制活性。对GST的抑制评估显示，所合成化合物的IC₅₀值范围为1.95 ± 0.492至3.61 ± 0.216 μM，标准抑制剂依他尼酸（ethacrynic acid，INN）的IC₅₀值为3.066 ± 0.475 μM。化合物4a表现出最强的GST抑制活性（IC₅₀ = 1.95 ± 0.492 μM），约为依他尼酸效力的1.6倍。5c（1.98 ± 0.420 μM）、3g（2.02 ± 0.229 μM）等13个化合物的IC₅₀值均低于依他尼酸。值得注意的是，化合物3f表现出最均衡的双重抑制谱，对AChE和GST的IC₅₀值分别为1.92 ± 0.291 μM和2.32 ± 0.810 μM。浓度-响应曲线呈现优异的线性（R² = 0.9531至0.9995），证实了抑制实验的稳健性和IC₅₀值的可靠性。

基于酶抑制结果，研究人员选取3e、3f、4b、4e、5d和5e六个活性最强的化合物，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）为阳性对照，采用MTT法评估其对HepG2细胞系在24 h和48 h处理后的细胞毒性。结果显示，化合物4b在24 h和48 h均表现出最强的细胞毒性效应，其抗增殖效果与阳性对照相当。3e和3f也表现出显著的细胞毒性活性，但弱于4b。化合物5e在48 h后表现出时间依赖性的细胞毒性增强。值得注意的是，4b尽管对目标酶的抑制活性相对温和，却表现出显著的细胞毒性，提示酶抑制效力和细胞毒性之间可能不存在直接关系，其细胞毒性可能涉及本研究未调查的其他细胞机制。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要技术方法包括：无溶剂缩合反应合成目标化合物；FT-IR、¹H NMR、¹³C NMR和LC-Q-TOF-MS进行结构表征；基于Habig和Jakoby方法的分光光度法测定GST抑制活性；基于Ellman比色法的AChE抑制活性测定；MTT法评估HepG2细胞毒性（HepG2细胞系购自Sigma-Aldrich，ECACC/Sigma-Aldrich目录号89081402）；AutoDock 4.2.6分子对接分析（靶标为人AChE，PDB ID：4EY7，2.35 ?分辨率）；GROMACS 2024.1分子动力学模拟（100 ns，AMBER14SB力场，GAFF配体参数）；MM/GBSA结合自由能计算和逐残基能量分解分析；SwissADME药代动力学性质预测。

四、研究结果

4.1 合成与结构表征

通过无溶剂缩合反应合成了21个含1,2,4-三唑–席夫碱片段的苯磺酸酯衍生物，产率80.80%–92.15%。FT-IR光谱中，三唑-5-酮环的N–H伸缩振动出现在3157–3190 cm^?1，甲亚胺C=N伸缩带出现在约1584–1600 cm^?1，三唑酮环的羰基C=O吸收出现在1690–1709 cm^?1。¹H NMR谱中，甲亚胺质子（N=CH）在约9.64–9.71 ppm处呈单峰，确认了席夫碱键的形成；三唑酮环的NH质子在12.00–12.36 ppm处呈特征性低场单峰。¹³C NMR谱与所提出的结构一致，三唑酮羰基碳在约151.4–151.8 ppm，三唑C=N碳在约151.1–151.5 ppm，甲亚胺碳在约152.1–155.3 ppm。对于5b和5d，可用的质谱数据未用于结构确认，其结构归属主要基于FT-IR、¹H NMR和¹³C NMR数据。

4.2 AChE和GST抑制活性

所合成化合物对AChE表现出低微摩尔范围的IC₅₀值（1.60–3.00 μM），化合物3e活性最强（IC₅₀ = 1.60 ± 0.198 μM）。对GST的IC₅₀值范围为1.95–3.61 μM，化合物4a活性最强（IC₅₀ = 1.95 ± 0.492 μM），效力约为依他尼酸的1.6倍。化合物3f表现出最均衡的双重抑制谱。这些结果表明所设计的骨架是有前景的多靶点药效团。

4.3 细胞毒性评价

MTT法评估显示，化合物4b在24 h和48 h均表现出与阳性对照5-FU相当的强细胞毒性。3e和3f也表现出显著但较弱的细胞毒性。5e在48 h后表现出时间依赖性的细胞毒性增强。所有所选化合物均显著降低HepG2细胞活力，凸显了其抗癌潜力。

4.4 分子对接与结合模式分析

分子对接分析以多奈哌齐重对接验证方案（RMSD = 0.54 ?），确认了方案的可靠性。所有21个衍生物均能有利地容纳于hAChE结合峡谷中，预测结合能范围为?13.10至?14.67 kcal/mol。化合物3e表现出最优结合能（?14.67 kcal/mol），与其实验中最强的AChE抑制活性定性一致。3e的详细结合模式分析显示其延伸占据AChE峡谷，与Trp86、Phe295、Arg296、Phe297、Tyr337、Tyr341和His447等残基建立氢键、疏水和π介导接触，同时涉及胆碱结合区、酰基口袋、外周区和催化三联体等多个功能亚位点。3f表现出与3e类似的结合模式。

4.5 分子动力学模拟

100 ns MD模拟显示，hAChE–3e、hAChE–3f和hAChE–多奈哌齐三个复合物在50–100 ns区间的平均主链RMSD分别为0.174 ± 0.012 nm、0.168 ± 0.010 nm和0.164 ± 0.011 nm，均保持稳定构象。配体RMSD分析显示，3e在50 ns后采用更稳定的结合取向（平均RMSD = 0.146 ± 0.028 nm），而3f表现出更大的位置波动（平均RMSD = 0.333 ± 0.031 nm）但仍保持结合。RMSF和回旋半径（Rg）分析表明三个复合物的整体柔性模式和蛋白紧凑性相似，无配体诱导的蛋白去折叠或主要结构域重排。氢键分析显示，3e在50–100 ns区间维持最高的平均蛋白–配体氢键数（1.86 ± 0.59），与对接分析中广泛的氢键网络一致。

4.6 结合自由能与逐残基分解

MM/GBSA计算（基于80–100 ns的200个快照）显示，多奈哌齐复合物具有最优的总结合自由能（ΔG_bind = ?53.35 ± 2.99 kcal/mol），其次是hAChE–3e（?35.15 ± 3.24 kcal/mol）和hAChE–3f（?25.34 ± 3.18 kcal/mol）。3e比3f更有利的静电贡献（?18.36 ± 3.47 vs. ?6.62 ± 4.85 kcal/mol）部分解释了其更优的结合能谱。逐残基分解分析确定了关键峡谷残基Trp86、Trp286、Tyr337、Tyr341、Phe295和Phe297作为配体稳定的重要贡献者。3e的主要有利贡献涉及Tyr337、Phe338、Trp286、His447、Leu289、Tyr341、Phe295、Trp86和Phe297，其中Tyr337贡献最强。SwissADME预测显示，3f和4a无Lipinski规则违例且生物利用度评分0.55，而3e有两个Lipinski违例和较低生物利用度评分0.17。

五、讨论与结论

讨论部分指出，所合成衍生物对AChE和GST均表现出低微摩尔范围的抑制活性，多个衍生物的抑制效力与标准抑制剂相当或更优。化合物3e是最强AChE抑制剂，4a具有最高GST抑制活性，3f表现出最有前景的均衡双重抑制谱。分子对接、MD模拟和MM/GBSA计算共同为实验观察到的AChE抑制活性提供了结构和能量学支持。3e和3f与多奈哌齐共享多个关键相互作用残基，表明所合成衍生物利用了参考抑制剂重要的相互作用热点。细胞毒性结果显示所选化合物显著降低HepG2细胞活力，其中4b效果最强。但4b的酶抑制活性相对温和，提示细胞毒性可能涉及其他未调查的细胞机制。

研究结论为：所合成的1,2,4-三唑功能化苯磺酸酯衍生物表现出强效的AChE和GST抑制活性以及有前景的HepG2细胞毒性效应，其中3e、4a和3f分别作为最强AChE抑制剂、最强GST抑制剂和最优双重抑制剂，是进一步生物学和药理学研究的候选先导化合物。计算分析为实验观察到的AChE抑制活性提供了结构和能量学支持，强调了Trp86、Trp286、Tyr337、Tyr341、Phe295和Phe297等关键峡谷残基在配体稳定中的重要性。这些发现表明所合成的衍生物作为靶向神经退行性疾病和癌症相关通路的多功能治疗剂具有开发潜力。