含1,2,4-三唑环的新型苯磺酸酯衍生物的合成及其乙酰胆碱酯酶与谷胱甘肽S-转移酶抑制活性及细胞毒性评价

《Pharmaceuticals》：Antimicrobial, Anti-Inflammatory, General Toxicity and Antioxidant Activities of Ultrasound-Assisted Extracts from Prunella vulgaris L.

　　

专业术语翻译的论文摘要 背景/目的: 本研究合成了一系列含有1,2,4-三唑环的新型苯磺酸酯衍生物。方法: 采用红外光谱(IR)、1H核磁共振(1H NMR)、13C核磁共振(13C NMR)以及四极杆飞行时间液相色谱-质谱联用(Q-TOF LC/MS)分析对其分子结构进行了表征。对于化合物5b和5d，可用的质谱数据未用于结构确认，其结构归属主要基于波谱数据。研究人员评估了所合成化合物(3–5)对乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)的抑制活性。结果: 与参比抑制剂多奈哌齐和依他尼酸相比，化合物3e在所有测试化合物中表现出最高的AChE抑制活性，半数抑制浓度(IC50)值为1.60 ± 0.198 μM。此外，化合物4a显示出显著的GST抑制活性，IC50值为1.95 ± 0.492 μM，其效力优于参比抑制剂。进一步评估了选定化合物在处理24小时和48小时后对HepG2细胞系的细胞毒性作用。总体而言，所合成的分子表现出强效的酶抑制活性以及有前景的细胞毒性效应，凸显了它们作为候选先导化合物进行进一步生物学研究的潜力。研究人员进行了计算机模拟分析，以阐明实验观察到的合成衍生物乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性的分子基础。针对人源AChE(hAChE, PDB ID: 4EY7)的分子对接确定化合物3e是该系列中最有利的结合物，而3f也表现出较强的结合特征。随后对hAChE–3e、hAChE–3f和hAChE–多奈哌齐复合物进行的100 ns分子动力学模拟显示，蛋白质构象稳定，配体在催化峡谷内持续容纳。分子力学/广义玻恩表面积(MM/GBSA)计算进一步表明，3e的结合能谱比3f更优，而多奈哌齐的整体计算结合能最为有利。残基能量分解突出了包括Trp86、Trp286、Tyr337、Tyr341、Phe295和Phe297在内的关键峡谷残基是配体稳定的重要贡献者。结论: 总体而言，这些计算结果为先导衍生物的实验观察到的AChE抑制活性提供了结构和能量上的支持。

论文解读文章

研究背景与目的

神经退行性疾病如阿尔茨海默病(AD)的治疗仍是重大医学挑战。胆碱能假说认为，通过抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)提高突触间隙乙酰胆碱水平是改善认知功能的关键策略。同时，AChE的外周阴离子位点(PAS)还参与促进淀粉样蛋白-β(Aβ)纤维形成，因此开发能同时靶向催化活性位点和PAS的多功能AChE抑制剂成为有前景的治疗方向。另一方面，谷胱甘肽S-转移酶(GST)作为II相解毒酶家族，在细胞抵御氧化和亲电应激中发挥核心作用。然而，在许多恶性肿瘤（包括肝细胞癌）中，GST同工酶的异常高表达与化疗耐药和不良预后密切相关。因此，选择性抑制GST活性以削弱肿瘤细胞的抗氧化防御系统，是增敏抗癌药物疗效的潜在策略。尽管AChE和GST参与不同的生理通路，但两者均是治疗复杂人类疾病的验证靶点。基于此，本研究旨在设计并合成一系列兼具AChE和GST抑制活性的新型杂环化合物，并评估其对肝癌细胞系HepG2的细胞毒性，探索其作为多靶点导向配体(MTDLs)的潜力。

研究方法概述

研究人员首先通过无溶剂缩合反应合成了一系列含有1,2,4-三唑-席夫碱片段的苯磺酸酯衍生物，并利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振氢谱(¹H NMR)、碳谱(¹³C NMR)和液相色谱-四极杆飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS)进行结构表征。随后，采用Ellman比色法测定化合物对电鳗AChE的抑制活性，采用Habig和Jakoby的方法测定对马肝胞质GST的抑制活性。基于酶抑制结果，选取活性最强的化合物，通过MTT法评估其对HepG2人肝细胞癌细胞系的体外细胞毒性。最后，运用AutoDock软件进行分子对接，并对代表性复合物进行100 ns的分子动力学(MD)模拟及分子力学/广义玻恩表面积(MM/GBSA)结合自由能计算，以阐释AChE抑制活性的分子机制。

研究结果

2.1 1,2,4-三唑-苯基苯磺酸酯(3–5)的合成

研究人员成功合成了三个系列共21个目标化合物，产率优良（80.80%-92.15%）。所有化合物的结构均经FT-IR、¹H NMR、¹³C NMR及LC-Q-TOF-MS确证。通过在对位引入不同电子供体(OCH₃)和吸电子基团(F, Cl, Br, I, NO₂)，系统地考察了取代基电子效应对生物活性的影响。

2.2 乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S-转移酶抑制活性

所有合成化合物均表现出微摩尔级别的AChE和GST抑制活性。在AChE抑制实验中，化合物3e（IC₅₀ = 1.60 ± 0.198 μM）活性最强。在GST抑制实验中，化合物4a（IC₅₀ = 1.95 ± 0.492 μM）活性最高，其效力约为阳性对照依他尼酸的1.6倍。值得注意的是，化合物3f展现出最均衡的双重抑制活性（AChE IC₅₀ = 1.92 ± 0.291 μM, GST IC₅₀ = 2.32 ± 0.810 μM），被认为是发展MTDLs的有前景候选物。

2.3 细胞毒性效应评价

选取酶抑制活性最强的6个化合物（3e, 3f, 4b, 4e, 5d, 5e）进行HepG2细胞毒性实验。结果表明，化合物4b在24小时和48小时处理后均表现出最显著的细胞毒性，效果与阳性对照5-氟尿嘧啶相当。化合物5e则表现出时间依赖性增强的细胞毒性。有趣的是，4b的细胞毒性与其相对温和的酶抑制活性并不完全对应，提示其可能涉及其他未被研究的细胞机制。

2.4 分子对接与结合模式分析

将21个化合物对接到人源AChE(hAChE, PDB ID: 4EY7)的活性位点峡谷中。结果显示，所有化合物均能良好地嵌入结合口袋，其中3e的结合能最低（-14.67 kcal/mol），与其最强的实验抑制活性一致。详细的相互作用分析表明，3e能与催化峡谷中的关键残基（如Trp86, Phe295, Arg296, Tyr337, Tyr341, His447等）形成广泛的氢键、疏水和π介导的接触，其结合模式跨越了胆碱结合区、酰基结合袋、外周阴离子位点及催化三联体等多个功能亚位点。

2.5 动态稳定性与结构行为

对hAChE–3e、hAChE–3f和hAChE–多奈哌齐复合物进行了100 ns MD模拟。所有体系的主链均方根偏差(RMSD)、回旋半径(Rg)和溶剂可及表面积(SASA)均保持稳定，表明蛋白整体构象稳定。配体RMSD分析显示，3e在模拟后期（50-100 ns）保持了较低的位置波动（平均0.146 nm），而3f则表现出更大的构象灵活性。氢键分析表明，3e在整个模拟过程中维持了最多的平均蛋白-配体氢键数（1.86个），为其稳定结合提供了支持。

2.6 结合自由能与残基能量分解

MM/GBSA计算表明，多奈哌齐的总结合自由能（ΔG_bind = -53.35 kcal/mol）最为有利，其次是3e（-35.15 kcal/mol）和3f（-25.34 kcal/mol），这与它们的实验IC₅₀趋势定性一致。范德华力是所有复合物结合的主要驱动力。残基能量分解揭示了3e的主要稳定化贡献来自Tyr337、Phe338、Trp286、His447、Leu289、Tyr341、Phe295、Trp86和Phe297等残基，这些残基与多奈哌齐的结合热点高度重叠，表明合成衍生物利用了与参比抑制剂相似的相互作用位点。

结论与讨论

本研究成功合成了一系列结构新颖的含1,2,4-三唑环的苯磺酸酯衍生物，并系统评价了其生物活性。实验结果表明，多个化合物展现出强效的AChE和GST双重抑制活性，以及对HepG2肝癌细胞系显著的细胞毒性。特别是化合物3e（最强的AChE抑制剂）、4a（最强的GST抑制剂）和3f（最均衡的双重抑制剂）被确定为最有潜力的先导化合物。分子对接、分子动力学模拟及MM/GBSA计算从原子层面揭示了这些化合物与hAChE的相互作用模式，阐明了其抑制活性的结构基础。本研究的结论是：“总体而言，这些计算结果为先导衍生物的实验观察到的AChE抑制活性提供了结构和能量上的支持。” 这些发现不仅丰富了具有多重药理活性的三唑类化合物库，也为开发针对神经退行性疾病和癌症的多靶点治疗药物提供了有价值的化学实体和理论指导。