基于多参数流式细胞术的CD19 CAR-T治疗后CAR-T与内源性T细胞纵向免疫重塑特征分析

《Cancers》：Longitudinal Flow Cytometric Profiling of CAR-T and Endogenous T Cells Following CD19 CAR-T Therapy

　　

背景/目的：CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞治疗后的纵向监测主要聚焦于CAR-T细胞的扩增，然而对CAR-T细胞和内源性T细胞进行全面的免疫表型特征分析仍十分有限。本研究采用多参数流式细胞术，探讨了替沙仑赛（tisagenlecleucel）治疗后的纵向免疫动力学变化。方法：研究人员前瞻性纳入19例接受替沙仑赛治疗的复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者（11例弥漫大B细胞淋巴瘤DLBCL和8例B细胞急性淋巴细胞白血病B-ALL）。在输注后前28天内连续采集外周血样本，分析CAR-T细胞动力学、分化状态、活化和耗竭标志物表达、纵向表型变化及其与治疗反应和免疫相关毒性的关联。结果：CAR-T细胞扩增主要在输注后第7天达到峰值。然而，在数例B-ALL患者中观察到延迟的峰值扩增。在扩增峰值期，CAR-T细胞富集中央记忆表型，其HLA-DR和PD-1表达显著高于内源性T细胞。在随访期间，中央记忆T细胞比例逐渐下降，而终末效应T细胞比例升高，同时伴随HLA-DR、PD-1和TIGIT表达的降低。尽管活化谱存在差异，CAR-T细胞与内源性T细胞展现出大致相似的分化模式。探索性分析进一步显示，发生免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）的患者具有更高的绝对CAR-T细胞计数。结论：这种临床适用的方法提供了超越单纯CAR-T细胞计数的免疫表型信息，可能有助于接受CAR-T细胞治疗患者的生物标志物发现和纵向免疫监测。

研究背景与科学问题

CD19嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已显著改善复发或难治性B细胞恶性肿瘤患者的生存预后，包括弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）。然而，疾病复发以及治疗相关毒性，尤其是细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），仍是主要的临床挑战。尽管已有多种临床和生物学因素被提出用于预测疗效和毒性，如基线肿瘤负荷、炎症标志物、CAR-T产品特性及早期扩增动力学，但目前仍缺乏临床稳健且经过一致验证的生物标志物。

现有监测策略大多集中于循环CAR-T细胞的定量检测，而对CAR-T细胞与内源性T细胞进行全面免疫表型特征的纵向研究仍然有限。越来越多的证据表明，内源性免疫区室同样参与治疗结局的调控。单细胞研究已揭示CAR-T治疗伴随着内源性T细胞群体的动态变化，特定T细胞状态与CAR-T细胞持久性和治疗应答相关。因此，在免疫监测中同步评估CAR-T细胞与内源性T细胞，对于理解治疗成功与毒性的生物学决定因素具有重要意义。

多参数流式细胞术具备独特优势，可同时定量CAR-T细胞和内源性T细胞，并表征其分化、活化和耗竭状态，从而提供超越单纯CAR-T细胞计数的整合性免疫信息。然而，全面评估这些免疫表型特征的纵向临床研究仍十分有限。为此，研究人员对接受替沙仑赛治疗的患者开展了纵向多参数流式细胞术免疫监测，旨在全面描述CAR-T治疗后CAR-T细胞与内源性T细胞的动态免疫表型变化，为阐明治疗应答和毒性的免疫学机制提供见解。

关键技术方法概述

研究人员在韩国首尔圣玛丽医院前瞻性入组了19例接受替沙仑赛（Kymriah）治疗的患者，包括8例B-ALL和11例DLBCL。在输注后第3、7、14、21和28天预设时间点采集外周血样本，共分析54份样本。采用包含12种抗体的多参数流式细胞术方案进行免疫表型分析，使用DxFLEX流式细胞仪采集数据并通过Kaluza软件进行分析。通过层级设门策略识别淋巴细胞、CD3⁺T细胞及CAR阳性（CAR-T细胞）与CAR阴性（内源性T细胞）亚群，并进一步分为CD4⁺和CD8⁺亚群。T细胞分化状态依据CCR7和CD45RA表达定义为初始T细胞（TN）、中央记忆T细胞（TCM）、效应记忆T细胞（TEM）和效应T细胞（TE）。HLA-DR、PD-1和TIGIT的表达水平以中位荧光强度（MFI）进行评估。峰值扩增定义为每位患者纵向样本中绝对循环CAR-T细胞计数最高的时间点，14例具有至少一次峰值后样本的患者纳入纵向配对分析。

研究结果

3.1 患者特征：入组时15例患者为复发疾病，4例为难治性疾病。B-ALL患者年龄显著低于DLBCL患者。所有B-ALL患者在输注后第30天均获得完全缓解（CR），而DLBCL患者呈现异质性反应。DLBCL患者≥2级CRS发生率高于B-ALL患者，ICANS仅见于DLBCL患者。

3.2 循环CAR-T细胞输注后扩增动力学：总体队列中，CAR-T细胞在输注后迅速扩增，中位百分比和绝对计数均在第7天达到峰值。DLBCL患者中73%（8/11）在第7天达峰，而B-ALL患者峰值时间变异更大，延迟峰值（超过第14天）仅见于B-ALL队列。

3.3 峰值扩增期CAR-T与内源性T细胞的免疫表型比较：在峰值扩增期，两种细胞群体呈现可比的分化谱，TCM均为主要亚群。CD4/CD8比值无显著差异，两群体均以CD8⁺为主。CD8⁺CAR-T细胞较内源性CD8⁺T细胞富集TCM并减少TEM。CAR-T细胞的HLA-DR和PD-1表达显著高于内源性T细胞，而TIGIT表达无显著差异。

3.4 峰值扩增后CAR-T细胞分化的变化：14例患者的配对分析显示，从峰值至随访期，TCM比例显著下降，TE和TN比例增加。与此一致，HLA-DR、PD-1和TIGIT表达均显著降低。

3.5 根据应答和毒性的T细胞表型探索性分析：DLBCL患者中，应答者显示内源性CD4⁺T细胞比例和CD8⁺TEM频率呈升高趋势，但未达统计学显著性。发生ICANS的两例患者绝对CAR-T计数显著高于无ICANS者，而CAR-T CD8⁺T细胞TIGIT表达则较低。

讨论与结论总结

本研究表明，大多数患者呈现CAR-T细胞在第7天左右达峰的典型扩增动力学，但B-ALL患者中观察到更大的异质性，可能反映疾病特异性抗原负荷和免疫微环境的差异。峰值期CAR-T细胞以CD8⁺占优，TCM为主要分化亚群，这与既往部分报道存在差异，可能归因于CAR结构、疾病背景、表型定义和分析平台的差异。CAR-T细胞较内源性T细胞具有更高的HLA-DR和PD-1表达，提示更强的激活相关表型改变。纵向观察中，TCM下降伴随TE增加及活化/耗竭标志物表达降低，表明CAR-T细胞经历从TCM主导的激活状态向更分化表型的动态演变。

值得注意的是，CAR-T细胞与内源性T细胞在峰值期呈现出大致相似的分化谱，提示CAR-T输注后的免疫重塑不仅局限于工程化细胞，也涉及内源性T细胞群体的协调性表型变化。探索性分析中，ICANS患者表现出更高的绝对CAR-T计数，与既往将更大体内扩增与神经毒性风险相关联的报告一致，但因病例数有限，临床意义尚不确定。

研究结论：研究人员的发现表明，多参数流式细胞术能够捕捉超越单纯CAR-T计数的动态免疫重塑，支持其作为CAR-T治疗后纵向免疫监测实用平台的潜在作用。