硅调控铜胁迫下黄瓜铜响应转运蛋白与非编码RNA表达的研究

《Plants》：Silicon Modulates the Expression of Copper-Responsive Transporters and Non-Coding RNAs in Cucumber Subjected to Copper Stress

过量铜（Cu）破坏植物体内的金属稳态并诱导氧化应激。硅（Si）已知能够缓解重金属毒性，但其在Cu胁迫下发挥保护作用的分子基础仍未得到充分理解。为解决这一问题，研究人员开展了一项探索性全转录组筛选，以鉴定黄瓜（Cucumis sativus cv. Chinese Long）中响应过量Cu和/或Si的候选差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）、长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）和微小RNA（microRNAs, miRNAs）。通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qRT-PCR）进一步分析了编码金属转运蛋白的基因以及选定的miRNA-靶基因对。单独施用Si即可调节大量候选DEGs的表达，尤其显著增强了金属转运蛋白基因的表达。过量Cu暴露抑制了参与金属吸收的基因，同时上调了与金属外排和再分布相关的基因。在Cu胁迫下施用Si缓解了这些转录改变。Cu胁迫抑制了miR398和miR408的表达，同时增加了其靶标——超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和植物蓝素（plantacyanin, PCY）的表达。此外，过量Cu下调了miR390，导致其预测的lncRNA靶标表达上调。在Cu胁迫植株中添加Si进一步增强了SOD的表达，同时减弱了PCY和该lncRNA的上调。结果表明，Si在最佳生长条件和Cu胁迫条件下均能调节编码RNA和非编码RNA的表达，揭示了转录后基因表达调控是Si作用于植物的另一层机制。结合先前报道的生理和生化数据，这些发现推进了研究人员对Si介导的植物重金属耐受性分子基础的理解。

铜（Cu）是植物光合作用和呼吸作用所必需的微量营养元素，作为多种含Cu蛋白的辅因子发挥功能。然而，过量Cu在形态、生理和分子水平上对植物产生毒害，其主要表现是Cu在根器官中的过度积累。植物依赖由吸收型转运蛋白（如COPT1、FRO4、IRT1、ZIP2等）和外排/区隔化转运蛋白（如HMA5、COPT5、YSL3等）组成的复杂网络来维持细胞内Cu稳态。在转录后水平，微小RNA（microRNAs, miRNAs）如miR398、miR408和miR390以及长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）也参与Cu稳态的调控。硅（Si）作为一种有益元素已被证明能够缓解重金属胁迫，在黄瓜中，Si可通过促进烟碱胺和组氨酸等螯合物质的合成以及增加Cu结合蛋白的积累来缓解Cu毒性。然而，Si在Cu胁迫下调控基因表达，尤其是对非编码RNA影响的分子基础仍不清楚，关于Cu与Si联合处理下miRNA和lncRNA表达谱的研究此前未见报道。本研究旨在系统探究Si补充对Cu胁迫黄瓜根中Cu吸收与转运相关基因以及非编码RNA表达的影响。

研究人员以黄瓜（Cucumis sativus cv. Chinese Long）为材料，设置对照（C）、单独Si、单独Cu以及Cu+Si联合（CuSi）四种处理，在处理后多个时间点进行mRNA和small RNA测序筛选，并利用qRT-PCR对转运蛋白基因、miRNA及其靶基因进行验证。研究发现，Si在最佳生长条件和Cu胁迫条件下均能调节编码RNA与非编码RNA的表达，且其调节具有选择性：一方面缓解了Cu诱导的大部分转录改变，另一方面强化了Cu/Zn-SOD的转录上调。该研究揭示转录后基因表达调控是Si缓解Cu胁迫的新机制，推进了对Si介导植物重金属耐受性分子基础的理解。

关键技术方法如下：植物材料为黄瓜（Cucumis sativus L. cv. Chinese Long），在贝尔格莱德大学分子遗传与遗传工程研究所水培。设C（0.2 μM CuSO₄）、Si（1.5 mM Si(OH)₄）、Cu（10 μM CuSO₄）、CuSi（10 μM CuSO₄+1.5 mM Si(OH)₄）四种处理，处理5天后取根进行mRNA和small RNA测序（Illumina NovaSeq平台）；候选DEGs通过edgeR鉴定，Gene Ontology（GO）和KEGG通路富集分析用于功能注释；miRNA靶基因通过psRobot预测。qRT-PCR在8h、1d、3d和5d四个时间点验证转运蛋白基因、miRNA及靶基因表达，以F-box和actin为内参基因、U6为miRNA内参。转录组测序未设生物学重复，结果作为筛选数据用于后续验证。

转录组分析结果显示，共检测到23998个转录本，其中14743个在所有处理中共同表达。与对照相比，Cu处理产生的候选DEGs数量最多；CuSi处理的转录组谱介于Cu与对照之间，提示Si缓解了Cu诱导的转录重编程。此外，Si单独处理即引起约1800个候选DEGs变化，表明Si在无胁迫条件下也主动调节基因表达。

候选DE lncRNA鉴定方面，约10%的转录本（2453个）被鉴定为lncRNA，长度大多为400–1000 bp。Cu处理相比对照产生最多的候选差异表达lncRNA。

候选DEGs功能分类方面，GO富集分析显示候选DEGs主要涉及“跨膜转运蛋白活性”和“DNA结合转录因子活性”等功能类别。KEGG分析表明苯丙烷生物合成是最显著富集的通路，且CuSi与Cu比较中该通路更多基因被下调，与Si缓解Cu诱导的酚类和木质素积累效应一致。

转运蛋白基因表达时间动态方面，qRT-PCR结果显示：Si单独处理在8小时即上调COPT1、FRO4、IRT1等吸收相关基因；Cu处理则抑制FRO4、IRT1、FRO2、ZIP2和COPT5，上调HMA5、NRAMP1、YSL3和ZIP4。CuSi联合处理中，Si对COPT1、FRO4、COPT5等的Cu抑制效应有缓和作用，但FRO2和IRT1仍受强烈抑制，表明Si对转运蛋白的转录调节具有基因特异性。

miRNAome分析方面，共鉴定出87个候选Cu和/或Si响应miRNA，包括62个已知和25个候选新miRNA。差异表达miRNA数量在Si vs对照和CuSi vs对照比较中最多。

qRT-PCR验证miRNA表达方面，Cu处理使miR398和miR408从8小时起至第5天持续下降；miR390在Cu和CuSi处理中均下降；miR168呈动态表达模式。

miRNA靶基因预测方面，psRobot预测显示miR398唯一靶标为Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD）；miR408靶向植物蓝素（PCY）；miR168靶向AGO1；miR390预测靶标包括两个lncRNA转录变异体及多个mRNA。

验证预测靶基因表达方面，第5天时Cu处理使PCY上调约11倍，对应miR408下调11倍，呈反向表达关系；CuSi处理中PCY上调6.5倍，低于Cu处理。SOD在CuSi处理中达对照的2.2倍，高于Cu单独处理。lncRNA在Cu处理中表达最高（2.4倍），CuSi处理中为1.6倍，其表达与miR390下调呈反向关系。

讨论部分指出，Si在无胁迫条件下引发的转录组变化表明其并非被动结构组分，而是主动调节养分吸收与转运相关分子过程。在Cu胁迫下，Si通过减弱苯丙烷代谢、调节转运蛋白表达以及增强抗氧化防御等多重机制缓解Cu毒。尤其值得注意的是，Si选择性强化Cu/Zn-SOD的转录上调并伴随miR398的持续抑制，与此前报道的Si增加SOD蛋白丰度和酶活性一致，表明抗氧化防御是Si作用的重要靶点。转录水平改变并非Si在黄瓜根中发挥效应的主要机制，其效应主要来自降低金属可利用性、增强Cu固定与解毒以及提高抗氧化能力。结论部分指出：Si在最佳和Cu胁迫条件下均能调节编码RNA和非编码RNA的表达，转录后基因表达调控是Si作用于植物的另一层机制；miR398对黄瓜SOD的调控作用以及miR390-lncRNA的相互关系仍需进一步功能验证。