《iScience》：StrokeTime: A comprehensive longitudinal scRNA-seq atlas of the ischemic mouse brain
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缺血性卒中触发脑内细胞景观深刻而动态的变化。为系统刻画这些动态变化，研究人员整合了来自21项小鼠卒中研究（103个样本；414,359个细胞）的单细胞RNA测序数据，涵盖多种模型及卒中后不同时间间隔。通过统一的计算流程，构建了覆盖缺血后超急性期、
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缺血性卒中触发脑内细胞景观深刻而动态的变化。为系统刻画这些动态变化，研究人员整合了来自21项小鼠卒中研究（103个样本；414,359个细胞）的单细胞RNA测序数据，涵盖多种模型及卒中后不同时间间隔。通过统一的计算流程，构建了覆盖缺血后超急性期、急性期、亚急性期和慢性期的StrokeTime小鼠脑单细胞图谱。该图谱包含17个主要细胞类别，以及髓系、淋巴系、血管、上皮、神经元和胶质细胞群内的120个精细转录状态。髓系细胞表现出最大的可塑性，包括驻留细胞和浸润细胞共有的疾病相关小胶质细胞/巨噬细胞（disease-associated microglia/macrophage，DAM）程序；而淋巴细胞则在谱系约束内呈现激活和调节特征。血管细胞和血管壁细胞从早期炎症及屏障破坏程序，转向后期纤维化和血管生成状态。StrokeTime描绘了汇聚性及细胞类型特异性的损伤反应，为研究缺血后脑免疫、组织重塑，以及为未来脑血管疾病的单细胞和单核研究提供基准，提供了一个重要资源。
论文解读
一、研究背景与问题
缺血性卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一，其引发的脑内多细胞反应在数分钟至数月内持续展开。实验和临床研究已证实，浸润性免疫细胞以及驻留的血管细胞、血管壁细胞和大胶质细胞共同协调继发性损伤与组织修复之间的平衡；然而，这些细胞在时间维度上的协调性转录动态仍未被完整定义。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技术极大地推动了健康和疾病状态下细胞异质性的理解，在多种神经病理中揭示了小胶质细胞、浸润性髓系细胞和血管细胞的多样化激活状态。然而，已有的卒中scRNA-seq研究通常聚焦于单一时间点、特定细胞类型或单一实验模型，限制了跨研究比较，也阻碍了对缺血损伤后时间轨迹和共享基因表达程序的统一认识。此外，脑缺血诱导的转录组变化在多大程度上跨卒中模型、性别和年龄保守，尚不清楚。细胞分离策略和靶向富集方法引入的偏差，也进一步干扰了细胞组成变化的解释和数据集整合。
二、研究内容与意义
为解决上述问题，研究人员系统检索并重新分析了截至2024年4月所有具有公开原始数据的小鼠局灶性脑缺血模型脑scRNA-seq数据集，采用标准化计算流程整合了主要来自C57BL/6小鼠短暂性大脑中动脉阻塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型的研究，以及光血栓（photothrombosis，PT）和永久性远端大脑中动脉阻塞（permanent distal middle cerebral artery occlusion，pdMCAO）模型的研究。样本按卒中后时间分为超急性期（1–12小时）、急性期（1–3天）、亚急性期（4–7天）和慢性期（≥14天），并纳入naive、假手术及对侧半球对照。整合结果构建了StrokeTime——一个覆盖缺血损伤时间进程的小鼠脑综合单细胞图谱。该图谱解析了主要细胞类别和精细转录状态，量化了各类别内细胞相对丰度随时间的变化，并绘制了缺血后脑中汇聚性和细胞类型特异性的损伤、炎症及修复程序。该图谱及其数据挖掘工具已公开，为卒中后脑免疫、组织重塑研究以及未来单细胞和单核研究的基准比较提供了重要资源。
三、主要关键技术方法
研究人员采用了一套统一的计算分析流程：首先系统检索并纳入21项已发表的小鼠卒中scRNA-seq研究（103个样本，414,359个细胞），样本主要来源于C57BL/6小鼠，以tMCAO模型为主，另有PT和pdMCAO模型；随后对整合数据进行批次校正（使用Harmony算法），通过聚类和注释鉴定出17个主要细胞类别；对每个细胞类别进行亚聚类分析，并结合伪时间分析、模块评分、差异表达分析以及多元方差置换检验（PERMANOVA）评估生物学和技术因素对数据方差的贡献。数据已存放于GEO数据库（GSE337349），代码已公开于GitHub。
四、研究结果
髓系细胞
髓系细胞表现出显著的转录可塑性，形成多状态连续体而非离散亚群。小胶质细胞（microglia，Mg）和单核细胞来源细胞（monocyte-derived cells，MdC）在卒中后呈现最显著的转录变化。卒中触发驻留（Mg和BAM）和浸润性巨噬细胞（MdC）共享的基因表达程序，以Spp1、Gpnmb、Fabp5、Apoe和Lgals3等基因上调为特征，该程序在不同疾病背景下被称为疾病相关小胶质细胞/巨噬细胞（DAM）、脂质相关巨噬细胞（LAM）或卒中相关髓系细胞（SAM）。DAM群体在髓系细胞类型内分为两个亚群（DAM1和DAM2），具有略有差异的转录组和时间分布特征。
驻留髓系细胞
小胶质细胞被注释为13个亚群。对照条件下以稳态（Mg.hom）和即刻早期基因（Mg.IEG）亚群为主。超急性期缺血损伤使Mg.hom比例减少约一半，炎症性小胶质细胞（Mg.infl）扩增超过2倍并持续至慢性期。急性期以DAM（Mg.DAM1-2）、氧化磷酸化（Mg.oxphos）和增殖性（Mg.prol）小胶质细胞显著增加为特征。Mg.DAM1高表达Spp1和Gpnmb，在急性期达峰；Mg.DAM2高表达Apoe，在亚急性和慢性期最丰富。值得注意的是，Serpine1（编码纤溶酶原激活物抑制剂-1）的表达主要见于小胶质细胞而非星形胶质细胞。
边界相关巨噬细胞（border-associated macrophages，BAM）分为脉络丛（ChP）相关和软脑膜/血管周围两大群体。稳态BAM（BAM.hom）在卒中后显著减少，而疾病相关BAM（BAM.DAM1和BAM.DAM2）在卒中后显著扩增，其中BAM.DAM2富集溶酶体酶，提示参与组织重塑。
外周髓系细胞
单核细胞在卒中后频率逐渐下降，而MdC巨噬细胞随时间扩增。MdC炎症亚群（MdC.infl）在不同阶段呈现动态转录重塑：超急性期呈现巨噬细胞活化和中性粒细胞募集特征，急性和亚急性期呈现“清理”表型（Arg1、Lgals3），亚急性和慢性期呈现组织重塑表型（Gpnmb、Spp1），慢性期呈现免疫调节特征（B2m、Ifi27l2a）。MdC中DAM特征在急性期出现并在亚急性期达峰。
中性粒细胞分为5个亚群。稳态中性粒细胞（Neu.hom）在对照和超急性期占主导，后期下降约50%；炎症性中性粒细胞（Neu.infl）在急性期后显著增加。将NeuMap参考图谱投射到卒中中性粒细胞上，发现卒中相关中性粒细胞与外周组织和肿瘤中的免疫抑制性中性粒细胞共享转录程序。
树突状细胞（dendritic cells，DC）分为7个亚群，频率在卒中时间进程中变化较小。单核细胞来源DC（MoDC）和干扰素刺激cDC2（cDC2.ISG）在早期阶段更突出，而激活cDC2（cDC2.act）、迁移DC（migDC）和cDC1在慢性期模块评分更高。
淋巴细胞：T细胞、固有淋巴样细胞和B细胞
与髓系细胞不同，淋巴细胞的转录分析紧密追踪其谱系身份，激活或分化状态严格限制在各谱系内。T细胞分为CD4、CD8、NKT、γδT细胞以及干扰素响应、核糖体蛋白和增殖亚群。卒中后观察到调节性T细胞（Treg）、γδT细胞和干扰素响应T细胞（Tc.ISG）扩增，CD4初始亚群减少。固有淋巴样细胞（ILC）由自然杀伤（NK）细胞和ILC2组成，卒中后ILC2频率降低，NK细胞随时间可能趋向组织驻留表型。B细胞分为8个亚群，频率相对稳定；年龄相关B细胞（Bc.ABC）在慢性期频率增加，调节性B细胞（Bc.reg）模块评分在慢性期最高。
血管细胞
内皮细胞（endothelial cells，EC）分为11个亚群。卒中引起毛细血管静脉和静脉亚群在超急性期急剧减少；静脉炎症亚群（EC.v.infl）在急性期达峰；血管生成亚群（EC.angio）在亚急性期显著富集并与静脉转录特征重叠，提示静脉内皮可能是卒中后新生血管出芽的主要来源。周细胞（pericytes，PC）分为稳态、代谢活跃和血管生成三个亚群，在亚急性期转向纤维化程序。平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMC）在急性期出现反应性和免疫特征亚群扩增，从急性期炎症/应激激活状态转向亚急性期纤维化/重塑表型。成纤维细胞（fibroblasts，FB）分为脑膜和脉络丛三个亚群，在急性和亚急性期表达肌成纤维细胞标志物（Cthrc1、Acta2、Lrrc15、Postn）。
大胶质细胞和神经元
神经元分为神经母细胞、兴奋性、抑制性、混合和纹状体神经元5个亚群，亚急性期神经元数量不足。少突胶质细胞（oligodendrocytes，OL）分为10个亚群，从祖细胞到成熟细胞。过渡态OL（OL.trans1和OL.trans2）在卒中后早期出现，提示少突胶质细胞分化和早期再髓鞘化程序在卒中后约一周达峰。星形胶质细胞（astrocytes，AC）分为6个主要亚群，反应性和瘢痕形成亚群在急性期突出，呈现A2样特征；营养性和细胞外基质亚群在慢性期增加。
室管膜细胞和上皮细胞
室管膜细胞分为稳态、即刻早期基因和反应性三个亚群，后两者在急性和亚急性期选择性扩增。脉络丛上皮细胞分为三个亚群，其中Epi.Cntn1在亚急性期选择性扩增。
五、讨论与结论
StrokeTime揭示转录可塑性高度依赖细胞类型：髓系、血管和血管壁细胞经历广泛状态转换，而淋巴细胞基本保持谱系锚定身份。髓系细胞中，DAM程序从超急性期到亚急性期逐步启动，并分化为时间上不同的DAM1和DAM2状态，提示其不仅参与急性碎片清除，还参与长期组织重塑。单核细胞来源巨噬细胞从早期炎症状态转变为组织重塑和免疫调节表型，且这种转变是现有细胞亚群内连续的转录重编程而非新亚群替换。中性粒细胞与外围组织和肿瘤中的免疫抑制性中性粒细胞共享转录程序。淋巴细胞选择性扩增调节性和组织适应程序。血管侧，毛细血管和静脉内皮细胞早期丧失血脑屏障相关特征，随后出现静脉驱动的血管生成；周细胞和平滑肌细胞从急性氧化和炎症程序转向亚急性纤维化状态。星形胶质细胞从稳态转向反应性和瘢痕形成亚群，后期富集营养性和细胞外基质程序。少突胶质细胞谱系在亚急性期出现过渡态和髓鞘形成状态峰值，提示再髓鞘化存在狭窄时间窗口。
研究结论指出，缺血后各细胞谱系的平行时间程序表明，损伤到修复的共享时间线协调了卒中后的多细胞反应：急性期以碎片清除和炎症信号为主，亚急性至慢性期转向纤维化和基质重塑程序。这些模式在发育来源不同的细胞类型中汇聚，提示脂质和碎片负荷、缺氧及局部细胞因子环境等共享外部线索是细胞状态转换的驱动因素。该图谱为整合未来单细胞和单核数据集、基准化新实验模型和干预措施、以及制定卒中后免疫调节和促修复干预的合理时机提供了可扩展框架。
