异补骨脂查尔酮靶向去泛素化酶OTUB1诱导PD-L1降解并增强抗肿瘤免疫

《Cell Reports Medicine》：Isobavachalcone targets deubiquitinase OTUB1 to induce PD-L1 degradation and enhances antitumor immunity

　　

PD-L1介导的免疫抑制是肿瘤免疫逃逸的关键机制，而PD-1/PD-L1阻断疗法仍受限于低应答率与获得性耐药。通过小分子筛选，研究人员鉴定出天然来源化合物异补骨脂查尔酮（isobavachalcone，IBC）可靶向去泛素化酶（deubiquitinase，DUB）OTUB1调控PD-L1稳态。机制上，IBC作用于OTUB1的His217残基并抑制其去泛素化酶活力，从而促进PD-L1的K48连接（K48-linked）多聚泛素化（polyubiquitination）及其依赖蛋白酶体（proteasome）的降解。功能上，IBC降低肿瘤细胞PD-L1表达并增强CD8+ T细胞介导的细胞毒作用。在PD-L1缺陷肿瘤模型中，IBC未能进一步增强抗肿瘤活性，表明PD-L1是IBC介导免疫调控所必需的。此外，IBC与抗CTLA-4疗法联用可进一步提升抗肿瘤疗效。上述结果凸显IBC作为促进PD-L1降解的潜在候选药物，并证明靶向OTUB1-PD-L1轴（OTUB1-PD-L1 axis）可改善免疫检查点疗法（immune checkpoint blockade，ICB）。

研究背景方面，癌症仍是全球重大健康挑战，PD-1/PD-L1轴是肿瘤免疫逃逸核心通路。PD-L1表达受转录与翻译后修饰调控，包括IFN-γ-JAK-STAT信号、泛素化与糖基化。PD-1/PD-L1抗体虽在多种肿瘤中延长生存，但60%–80%患者发生原发或获得性耐药，且抗体药物存在组织穿透差、需静脉给药、年费用常超10万美元、免疫相关不良反应达15%–25%等局限，因此亟需可灵活调控PD-L1的小分子替代策略。该研究发表于《Cell Reports Medicine》，研究人员通过天然化合物库筛选发现IBC可下调PD-L1，并系统证明其通过抑制OTUB1促进PD-L1经K48连接泛素化而由26S蛋白酶体降解，在同源小鼠模型与AOM/DSS结肠炎相关肠癌模型中重塑肿瘤免疫微环境，且IBC联合抗CTLA-4疗效接近双免疫检查点抗体组合，具有重要意义。

关键技术方法方面，研究人员以RKO等高PD-L1表达细胞进行天然小分子库筛选；用RT-qPCR、环己酰亚胺（cycloheximide，CHX）追踪、MG132/氯喹/巴弗洛霉素A1等通路抑制剂判定PD-L1经泛素-蛋白酶体降解；以Ub-Rho荧光法、药物亲和响应靶点稳定性（drug affinity-responsive target stability，DARTS）、细胞热位移（cellular thermal shift assay，CETSA）、微观热泳（microscale thermophoresis，MST）证明IBC结合OTUB1且His217为关键位点；用OTUB1过表达/敲低及位点突变 rescue 实验验证轴系；体内采用C57BL/6J皮下MC38与Lewis肺癌模型、PD-L1-KO MC38模型、裸鼠模型及AOM/DSS肠癌模型；临床部分来自上海长征医院15例局部晚期直肠腺癌接受替雷利珠单抗联合CAPOX新辅助治疗患者标本与TCGA、TIMER 2.0公共数据。

研究结果如下。IBC mediates the negative regulation of PD-L1 expression：研究人员通过免疫印迹、免疫荧光与流式证明IBC浓度与时间依赖性下调结直肠与肺癌细胞总及膜PD-L1，且不直接抑制增殖，但在活化Jurkat T细胞共培养中增敏肿瘤细胞杀伤。IBC inhibits tumor growth in the subcutaneous Lewis and MC38 models：在MC38与Lewis皮下模型中，口服IBC剂量依赖性抑瘤，肿瘤组织可测到IBC；PD-L1-KO肿瘤中IBC无额外获益，裸鼠中失效；流式与IHC显示Treg（CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞）和MDSC（CD11b⁺Gr-1⁺髓源抑制细胞）减少，颗粒酶B（granzyme B，GzmB）⁺ CD8⁺ T细胞、NK、B细胞、树突细胞增加，PD-L1、Ki-67下降，CD4/CD8浸润与cleaved caspase-3上升。IBC alleviates pathological symptoms in AOM/DSS-induced colitis-associated cancer mice：AOM/DSS模型中IBC恢复结肠长度、减少大肿瘤、改善上皮异型，IHC见PD-L1/Foxp3/Ki-67降低，CD4/CD8与cleaved caspase-3升高。IBC facilitates PD-L1 degradation via the induction of K48-linked ubiquitination：IBC不影响PD-L1 mRNA，CHX示蛋白半衰期缩短，仅MG132逆转下调；K48R泛素突变消除IBC效应，K63R无影响，证明为K48-linked ubiquitination经proteasome降解。IBC targets OTUB1 at His217 to promote PD-L1 degradation：过表达OTUB1减弱IBC效应，敲低则无进一步下调；Co-IP证OTUB1与PD-L1互作；DARTS/CETSA/MST示IBC结合OTUB1，野生型Kd为5.41 μM，E195A部分削弱，H217A突变消除结合并阻断PD-L1降解，确定His217为功能关键。Enhanced antitumor activity of IBC combined with CTLA-4 blockade：IBC单药疗效似抗PD-L1/抗CTLA-4；IBC+抗CTLA-4在MC38达TGI 94.91%，近双抗体94.35%，显著压制Treg/MDSC、扩增GzmB⁺ T/NK/B细胞、促M1巨噬与抗原提呈，无显著毒性。PD-L1 and OTUB1 expression levels are associated with immunotherapy response：15例直肠癌中OTUB1与PD-L1双阳者更多为应答者；TCGA与TIMER 2.0示OTUB1高表达与CD8⁺ T细胞负相关、与Treg正相关；接受抗PD-1人群高CD274/OTUB1生存更佳；MSI-H（microsatellite instability-high，微卫星高度不稳定）结直肠癌与胃腺癌中CD274/OTUB1上调。

讨论部分总结：研究人员指出IBC通过His217抑制OTUB1去泛素化，破坏PD-L1稳态并促进其K48-linked ubiquitination与蛋白酶体降解；PD-L1缺陷与裸鼠实验共同证明疗效依赖肿瘤细胞PD-L1与适应性免疫。OTUB1作为PD-L1稳定因子具药理可靶向性。IBC+抗CTLA-4分别作用于T细胞启动与肿瘤PD-L1，机制互补且毒副较低。临床与公共数据支持OTUB1-PD-L1轴与ICB应答相关，但需大队列验证。AOM/DSS结果提示该轴也参与炎症相关肿瘤发生。

研究结论部分翻译：本研究鉴定天然化合物IBC为OTUB1介导去泛素化的调节剂。机制上，IBC通过依赖OTUB1 His217残基的相互作用抑制OTUB1对PD-L1的去泛素化，从而破坏PD-L1蛋白稳定性并促进其K48连接泛素化及蛋白酶体依赖降解。在多种小鼠肿瘤模型中，IBC展现强效抗肿瘤活性，其与抗CTLA-4联用进一步增强疗效。在PD-L1缺陷模型中IBC无额外作用，在免疫缺陷裸鼠中失活，证明抗肿瘤活性依赖于肿瘤细胞来源PD-L1与完整宿主适应性免疫。这些发现揭示OTUB1-PD-L1轴在肿瘤免疫逃逸中的重要作用，并为通过靶向蛋白稳态调控增强抗肿瘤免疫提供潜在治疗策略。