《NeuroSci》：Direct Comparison of Two Commonly Used Prenatal Valproate Doses Identifies Different Sex- and Age-Related Neurobehavioral Outcomes Across Development
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丙戊酸（VPA）是一种广泛使用的抗惊厥药和心境稳定剂，也是一种已知的致畸原，与神经管缺陷和神经发育障碍（包括孤独症谱系障碍（ASD））相关。产前VPA暴露被广泛用于在啮齿动物中建模ASD样行为；然而，常用剂量之间的直接比较尚缺乏。研究人员比较了两种广泛使用的V
丙戊酸（VPA）是一种广泛使用的抗惊厥药和心境稳定剂，也是一种已知的致畸原，与神经管缺陷和神经发育障碍（包括孤独症谱系障碍（ASD））相关。产前VPA暴露被广泛用于在啮齿动物中建模ASD样行为；然而，常用剂量之间的直接比较尚缺乏。研究人员比较了两种广泛使用的VPA剂量（300和600 mg/kg），在胚胎第12.5天（E12.5）对孕鼠进行给药。对雄性和雌性后代进行纵向评估，涵盖早期神经发育、超声发声、运动活性、焦虑相关行为、社交性和自发交替行为。早期发育基本得以保留，尽管VPA300延迟了悬崖回避能力的获得。总超声发声产量未受影响，而特定叫声类型发生改变。后期的行为效应在不同剂量、性别和年龄之间存在差异。在雄性中，运动活性和中央区探索得以保留，两种VPA剂量均降低了社交性，VPA300在出生后第70天（PND70）降低了自发交替行为。在雌性中，VPA600在PND30和VPA300在PND70降低了运动活性，VPA600降低了中央区探索，VPA300在两个年龄及VPA600在PND70均降低了社交性。VPA600还与更高的胚胎死亡率相关。这些发现表明，两种VPA剂量与不同的发育和行为结局模式相关，而非在较高剂量下呈现一致的严重程度增加。
论文解读
一、研究背景与目的
丙戊酸（VPA）是一种广泛使用的抗惊厥药和心境稳定剂，同时也是已知的强效致畸原。孕期早期服用VPA可使神经管缺陷（NTDs）风险增加10至20倍（达1–2%），先天性畸形总体风险增加至8–10%，并与自发性流产率升高、新生儿体重降低及多种脑畸形相关。作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，VPA通过表观遗传染色质重塑调节神经传递和基因表达。产前VPA暴露在啮齿动物中被广泛用于建模孤独症谱系障碍（ASD）样行为，但既往研究多采用单一剂量、单一时间点的实验设计，不同剂量之间的直接比较十分缺乏。现有文献提示，不同产前VPA剂量（300–800 mg/kg）可能产生不同的行为和分子模式，而非简单地随剂量增加而严重程度递增。此外，ASD在男性中的诊断频率约为女性的3至4倍，但啮齿动物VPA模型中的性别特异性效应尚不一致。不同品系小鼠对VPA的敏感性也存在差异：远交ICR小鼠在300 mg/kg剂量下即可观察到ASD样行为改变，而近交C57BL/6小鼠通常需要约600 mg/kg才能获得稳健的行为表型，且伴随更高的胚胎丢失率。因此，增加VPA剂量究竟是简单地加重行为严重程度，还是产生不同的年龄和性别依赖性发育及行为结局模式，这一问题尚不清楚。本研究旨在同一品系（ICR小鼠）和相同实验条件下，直接比较E12.5给药的两个常用剂量（300和600 mg/kg），以回答上述问题。
二、研究设计与方法概述
研究人员采用纵向实验设计，在ICR小鼠E12.5天对孕鼠进行单次皮下注射VPA 300 mg/kg或600 mg/kg，对照组注射等量生理盐水。从出生后第3天（PND3）至第70天（PND70）对雄性和雌性后代进行系统的神经行为学评估。主要技术方法包括：超声发声（USV）记录与分析（采用VocalMat机器学习方法对11类叫声进行分类）；神经发育里程碑评估（翻正反射、悬崖回避、负向地性、睁眼时间）；旷场实验（运动活性和焦虑相关行为）；Y迷宫自发交替实验（空间工作记忆）；三箱社交实验（社交性）。统计分析采用线性混合效应模型，以窝别为随机效应，并对重复测量数据进行适当协方差结构建模。胚胎毒性评估在E16.0进行，以每窝为实验单位统计胚胎死亡率。
三、研究结果
3.1 产前VPA 300 mg/kg和600 mg/kg处理对胚胎死亡率的影响
在E16.0评估胚胎死亡率，生理盐水组、VPA300组和VPA600组的合并描述性死亡率分别为0.95%、8.5%和33.7%。Kruskal–Wallis检验显示组间差异显著（p = 0.006），Dunn多重比较显示VPA600组死亡率显著高于生理盐水组（校正p = 0.0091），而VPA300与生理盐水无显著差异。平均窝产仔数在各组间相当，表明该效应反映的是胚胎死亡增加而非生育力改变。
3.2 产前VPA处理对出生后体重增长和睁眼时间的影响
体重从PND3至PND21在各组中均进行性增长，总体处理效应不显著（p = 0.468），但存在显著的Treatment × Age（p < 0.001）和Treatment × Sex × Age交互作用（p = 0.014）。雄性中，VPA600组在PND14、PND15和PND17的体重显著高于VPA300组；雌性中未检测到显著的成对处理差异。重要的是，两种VPA剂量在任何时间点与生理盐水均无显著差异，表明产前VPA暴露未损害出生后生长。睁眼时间在各处理组间无显著差异。
3.3 产前VPA处理对超声发声数量和叫声类型组成的影响
总USV叫声数量呈现显著的年龄相关发育轨迹，在PND8达到峰值，PND14下降，但处理效应不显著（p = 0.640），性别效应亦不显著。在个体音节类型分析中，Flat叫声呈现显著的Treatment × Age交互作用（p < 0.001，FDR校正后q ≤ 0.011）。在PND8，雄性VPA300组和VPA600组的Flat叫声数量均显著低于生理盐水组（p = 0.049和p = 0.029），雌性中未检测到显著处理差异。其他低频音节类型（如complex和reverse-chevron叫声）虽显示统计学交互作用，但因发生频率极低，不具稳健的生物学解释价值。
3.4 产前VPA暴露对早期神经发育里程碑的影响
翻正反射和负向地性的获得时间在各处理组间无显著差异。悬崖回避呈现最显著的处理效应：混合效应模型显示处理主效应显著（p = 0.018），Bonferroni校正成对比较显示VPA300雌性的获得时间显著晚于生理盐水组（p = 0.011）和VPA600雌性（p = 0.009）。Cox回归分析确认VPA300组悬崖回避获得的风险比（HR）为0.611（95% CI 0.422–0.885，p = 0.012），与获得延迟一致，而VPA600与生理盐水无显著差异。几乎所有后代均在评估期内最终获得各里程碑，表明是成熟时间改变而非持续性损伤。
3.5 产前VPA暴露对PND30（青春期）和PND70（成年期）行为特征的影响
3.5.1 旷场实验中的运动活性和中央区探索
运动活性呈现年龄和性别依赖性变化。雄性中，两种VPA剂量在PND30和PND70均未显著改变运动距离。雌性中，VPA600在PND30降低运动距离（p = 0.001），而VPA300在PND70降低运动距离（p = 0.005）。中央区探索方面，雄性无显著处理差异；雌性中，VPA600在PND30（p = 0.045）和PND70（p = 0.026）均减少中央区停留时间，且在PND30还显著低于VPA300组（p = 0.013）。值得注意的是，PND30时VPA600雌性中央区时间减少伴随运动活性下降，限制了其作为焦虑相关指标的解读；而PND70时中央区时间仍减少但运动活性无显著变化。
3.5.2 三箱社交实验中的社交性
习惯化阶段未发现初始侧偏好差异。生理盐水组雄性和雌性在PND30和PND70均显著偏好陌生鼠（均p < 0.001）。VPA300组在PND70出现陌生鼠偏好逆转（雄性和雌性均显著偏好空笼侧）。社交性指数分析显示：雄性中，VPA300和VPA600在PND30和PND70均显著降低社交性（均p < 0.001至p = 0.001），两种剂量间无显著差异；雌性中，VPA300在PND30降低社交性（p = 0.004），PND70时两种剂量均降低社交性（VPA300 p < 0.001，VPA600 p = 0.019）。存在显著的Treatment × Sex（p = 0.044）和Treatment × Age（p = 0.010）交互作用。
3.5.3 Y迷宫自发交替和臂进入次数
自发交替在PND30无显著处理差异，而在PND70，VPA300雄性显著低于生理盐水组（p = 0.007），VPA600雄性无显著差异；雌性中两个年龄均无显著成对处理差异。总臂进入次数方面，雄性在两个年龄均无显著差异；雌性中，VPA300在PND70臂进入次数显著高于生理盐水组（p = 0.035）。VPA300雄性在PND70的自发交替降低并非由臂进入频率减少所致，而VPA300雌性臂进入增加未伴随自发交替显著改变。
四、讨论与结论
本研究的核心发现是：产前VPA暴露并未随剂量增加而产生一致的严重程度递增效应，两种剂量与不同的发育和行为结局模式相关。VPA600组胚胎死亡率显著升高（33.7%），提示存活后代可能代表一个经选择的亚群，这可能解释了较高剂量下未观察到一致性更严重行为表型的现象。性别因素在部分行为结局中发挥作用，社交性存在显著的Treatment × Sex交互作用，运动活性存在显著的Treatment × Sex × Age交互作用，但部分仅在单一性别中观察到的效应缺乏显著的高阶交互作用支持，不应被解读为统计学确立的性别特异性效应。早期神经发育里程碑基本保留，而后期行为改变更为明显，提示产前干扰可能在高阶皮层网络成熟后才表现为行为异常。USV总量未受显著影响，与部分既往研究不同，可能归因于实验程序差异（本研究在单独记录前将幼崽与母鼠分离30分钟但保持与同窝同伴在一起）。品系背景也是重要考量因素：本研究在远交ICR小鼠中进行，而许多既往研究使用近交C57BL/6小鼠，不同品系对VPA的敏感性存在差异。研究结论指出：在存活后代中，从300到600 mg/kg未观察到行为严重程度的一致性单调递增；两种常用剂量与部分不同的发育和行为结局模式相关；600 mg/kg显著更高的胚胎死亡率使存活后代的行为比较复杂化，并可能解释了较高剂量下缺乏一致性更严重行为表型的现象；行为改变在较晚发育阶段出现而早期感觉运动发育相对保留，强调了发育时间窗在评估产前VPA暴露后果中的重要性。
