膳食蛋白质缺乏通过破坏肠道微生物胆汁酸代谢促进高耐药肺炎克雷伯菌肠道定植

《mSphere》：Protein malnutrition facilitates intestinal colonization with highly resistant Klebsiella pneumoniae through disrupted intestinal microbial metabolism

　　

儿童感染高耐药肺炎克雷伯菌（HR-Kp）在低收入国家尤为常见，而这些国家儿童营养不良普遍存在。营养不良已被确定为HR-Kp及其他耐抗菌药物肠杆菌目（Enterobacterales）感染的风险因素，但其机制基础以及与儿童中其他常见暴露因素（如抗生素使用）的独立关联尚不明确。研究人员利用小儿营养不良小鼠模型发现，与营养充足的小鼠相比，饲喂蛋白质缺乏饮食（PD）的小鼠在低4个对数级的攻击接种量下更易被HR-Kp定植，并产生高3个对数级的肠道载菌量。PD饲喂小鼠的HR-Kp定植持续超过5周，且定植可传播至饮食匹配的同笼同伴。抗生素处理导致不同饮食组间HR-Kp定植载量相似，提示营养依赖性定植风险由改变的肠道微生物群驱动。尽管膳食蛋白质摄入减少，PD饲喂小鼠的肠道氨基酸含量仍得以维持，支持HR-Kp的最佳生长。此外，次级胆汁酸——典型的肠道微生物衍生分子——在PD饲喂小鼠中减少，其与HR-Kp体内载量呈负相关，并在体外部分抑制HR-Kp生长。综上，这些发现揭示了膳食蛋白质摄入在决定营养依赖性HR-Kp定植抵抗中的作用。

论文解读

一、研究背景与科学问题

抗菌药物耐药细菌已成为全球紧迫的公共卫生威胁，2019年造成全球超过100万例死亡，预计到2050年每年死亡人数将增至近200万。高耐药肠杆菌目（HRE）是这一全球耐药负担的主要贡献者之一，其中高耐药肺炎克雷伯菌（HR-Kp）对超广谱β-内酰胺类和碳青霉烯类抗生素具有耐药性，治疗极为困难。过去二十年间，HRE和HR-Kp感染在低收入和中等收入国家的儿童中急剧上升，尤其是在儿童营养不良高发的地区。在一项马拉维严重急性营养不良（SAM）住院儿童队列中，80.3%的患儿入院时至少定植一种HRE菌株，其中46.8%定植HR-Kp；相比之下，撒哈拉以南非洲多个儿科队列的荟萃分析报告HRE携带率为32.2%，HR-Kp携带率为11.8%。尼日尔的研究还报告，SAM住院儿童在住院期间超过95%出现HRE肠道定植，且出院后HRE可传播至家庭接触者。

然而，营养不良管理指南中抗生素的使用以及医院或社区环境暴露的增加，都是难以与营养缺乏本身对肠道定植风险的影响相区分的混杂风险因素。因此，确定营养如何直接影响HRE和HR-Kp定植，对于在脆弱全球人群中对抗这些病原体的获得与传播至关重要。膳食蛋白质摄入不足是儿科人群营养不良的主要驱动因素。蛋白质缺乏小鼠模型可再现儿童蛋白质营养不良的重要特征，包括生长受限、肠道生物学改变以及对包括肠杆菌目在内的腹泻原病原体易感性增强。基于此，研究人员开发了一种新的幼年小鼠定植模型，以确定蛋白质营养不良是否独立于其他暴露因素促进HR-Kp肠道定植。

二、研究设计与主要结论

研究人员使用表达bla_OXA-48和bla_CTX-M-15的碳青霉烯耐药HR-Kp临床分离株Kp175（属于全球传播的ST307谱系），建立了小鼠肠道定植模型。研究发现，蛋白质缺乏饮食（PD）喂养的小鼠在低4个对数级的攻击接种量下即可被HR-Kp定植，并产生高3个对数级的肠道载菌量；定植持续超过5周，并可传播至饮食匹配的同笼同伴。营养恢复（从PD转为复杂蛋白充足饮食CD）并不能逆转已建立的定植。尽管PD饮食中氨基酸含量较低，PD喂养小鼠的肠道氨基酸含量与CD喂养小鼠无显著差异，支持HR-Kp的最佳生长。抗生素处理消除饮食组间定植差异，提示营养依赖性定植风险由肠道微生物群驱动。进一步研究发现，PD喂养小鼠中多种次级胆汁酸（如脱氧胆酸DCA、12-酮石胆酸、猪脱氧胆酸HDCA）显著减少，这些次级胆汁酸与HR-Kp体内载量呈负相关，并在体外以剂量依赖方式部分抑制HR-Kp生长。这些结果首次建立了膳食蛋白质缺乏、胆汁酸代谢与高耐药肺炎克雷伯菌肠道定植之间的直接机制联系。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：1）小鼠模型：采用C57BL/6J雄性小鼠（3-4周龄，购自Jackson Laboratories），饲喂蛋白质缺乏纯化饮食（PD，2%酪蛋白）或对照复杂饮食（CD，20%蛋白质），部分实验使用无菌（germ-free）小鼠；2）细菌定植模型：通过口饲灌胃接种HR-Kp临床分离株（Kp175、ARLG-4605、ARLG-4404），粪便和肠道内容物经美罗培南选择性MacConkey琼脂培养定量；3）16S rRNA扩增子测序分析肠道微生物群组成；4）液相色谱-串联质谱（LC-MS）靶向代谢组学定量胆汁酸和氨基酸；5）体外生长实验评估饮食、氨基酸和次级胆汁酸对HR-Kp生长的影响；6）qPCR定量总细菌载量。

四、研究结果

HR-Kp定植建立和肠道载量具有营养依赖性。 在无抗生素处理条件下，PD喂养小鼠以10² CFU剂量即可实现50%定植率，而CD喂养小鼠需要10⁶ CFU；PD喂养小鼠的峰值粪便排菌量比CD喂养小鼠高2-4个对数级。不同HR-Kp临床分离株表现出不同的营养依赖性定植能力：ST307谱系的Kp175和ST11谱系的ARLG-4605在PD喂养小鼠中定植良好，而ST378谱系的ARLG-4404仅在少数PD喂养小鼠中定植。

HR-Kp传播具有营养依赖性。 在同笼共居传播实验中，所有PD喂养的指示小鼠均将其定植传播给未暴露的同笼同伴，而CD喂养小鼠即使在二次接种后也未发生传播。使用等热量成分匹配的纯化完全蛋白饮食（CP，20%酪蛋白）的对照实验显示，PD喂养小鼠8/8定植，CP喂养小鼠4/8定植，CD喂养小鼠1/8定植，表明纯化饮食本身降低定植抵抗，而蛋白质缺乏进一步加剧这一效应。

营养恢复不能逆转Kp175定植。 在PD喂养小鼠建立定植后，改用CD饮食并未降低粪便载菌量，尽管小鼠出现体重增长，提示饮食缺乏可能打开了一个稳定的生态位，一旦定植建立，单纯饮食恢复难以逆转。

肠道空间氨基酸可用性支持Kp175生长和定植，与膳食蛋白质摄入无关。 体外实验显示PD食物补充的培养基中Kp175生长低于CD食物补充的培养基，但PD和CD喂养小鼠的盲肠内容物过滤液支持相似的Kp175生长。氨基酸定量显示PD和CD喂养小鼠盲肠中所有检测氨基酸的绝对含量无显著差异，且PD喂养小鼠盲肠氨基酸与饮食输入的比值接近或高于1，而CD喂养小鼠该比值在0.001-0.1之间，表明肠道微环境适应蛋白质缺乏以增加氨基酸可及性。

营养依赖性定植抵抗需要肠道微生物群的持续存在。 PD和CD喂养小鼠的总微生物数量（基于23S DNA含量）无差异，但PD喂养小鼠中Oscillospirales和Lachnospirales目的多个属显著减少。在已定植小鼠中加用氨苄青霉素破坏微生物群后，CD喂养小鼠的Kp175扩增程度（6个对数级）大于PD喂养小鼠（3个对数级），且CD喂养小鼠的最终定植载量显著高于PD喂养小鼠。无菌小鼠实验中，两种饮食均支持高水平的盲肠定植，PD饮食下略有降低。这些结果表明微生物群介导的相互作用是营养影响Kp175定植的主要途径。

PD饮食导致抑制Kp175的胆汁酸浓度降低。 LC-MS分析显示PD喂养小鼠多种次级胆汁酸（DCA、12-酮石胆酸、HDCA）较CD喂养小鼠减少1个对数级以上。氨苄青霉素处理无论饮食如何均降低所有检测的次级胆汁酸，并伴随某些结合型初级胆汁酸的增加。在所有定植小鼠中，Kp175盲肠载量与未代谢的结合型初级胆汁酸浓度呈正相关，与多种次级胆汁酸浓度呈显著负相关。DCA、HDCA和石胆酸（LCA）在体外以剂量依赖方式抑制Kp175生长，DCA在500 nmol/mL（接近生理浓度）时即产生显著抑制，在2500 nmol/mL时产生10倍生长抑制。

五、讨论与结论

该研究通过小鼠模型证明，仅膳食因素即可在无混杂暴露条件下直接增加HR-Kp肠道定植的易感性。Kp175在营养不良宿主中仅需100个细菌细胞的最小暴露即可扩增定植，这一暴露量低于低收入国家儿童每日可能摄入的肠杆菌目数量。PD喂养小鼠的定植可传播至同笼同伴，提示蛋白质营养不良可能促进环境污染和潜在传播，但应注意小鼠存在食粪行为，降低了传播屏障。

该研究首次将膳食蛋白质缺乏、胆汁酸代谢和HR-Kp肠道定植建立直接机制联系。研究发现与Shen等人最近报道的酒精诱导菌群失调小鼠中次级胆汁酸含量与Kp定植呈负相关的结果一致。但需注意，体外抑制Kp所需的单个次级胆汁酸浓度达到或超过体内全肠道内容物所见生理上限，提示在健康小鼠肠道微环境中，次级胆汁酸可能达到区域性抑制浓度，并与其他微生物来源的抑制因子协同作用。PD喂养小鼠中Oscillospiraceae科（与次级胆汁酸和短链脂肪酸产生相关）的多个属减少，可能共同导致定植抵抗的丧失。

该模型允许仅通过饮食改变即可实现HR-Kp定植，无需抗生素介导的微生物群耗竭，为研究营养状态如何调控HR-Kp定植抵抗提供了新平台。未来研究将更精确地鉴定预防定植的关键微生物成员和功能，以及人类生命周期中可能影响肠道定植的常见饮食缺乏类型，为通过营养和益生菌/益生元干预策略应对这些病原体的全球影响奠定基础。