囊性纤维化患者来源的金黄色葡萄球菌菌株全基因组测序与系统发育分析

《Microbiology Resource Announcements》：Draft genome sequences for six Staphylococcus aureus isolates from cystic fibrosis patients in Oklahoma

　　

摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）可引起多种感染，当其在囊性纤维化（CF）患者的肺部存在时，可能危及生命。为了拓展对CF肺病中金黄色葡萄球菌感染的现有认知，我们报告了从美国俄克拉荷马州CF患者中分离的六个金黄色葡萄球菌菌株的基因组。

通告

囊性纤维化（CF）是一种遗传性疾病，其特征是由多种病原体反复和慢性感染肺部，包括金黄色葡萄球菌（1, 2）。金黄色葡萄球菌感染见于各年龄段CF患者，但在儿童中更为常见（3, 4）。然而，随着其他细菌（如铜绿假单胞菌）变得越来越普遍，其发病率随年龄增长而下降。因此，肺部急性加重的频率更高，从而增加了抗生素耐药的风险（5）。

痰液样本采集自美国俄克拉荷马城俄克拉荷马儿童医院肺部及囊性纤维化诊所的CF患者（伦理委员会豁免）。样本在包括营养琼脂（NA）在内的选择性培养基上培养，在37°C下孵育96小时，所得微生物生长物以10%脱脂牛奶保存为混合培养物，储存于?80°C。分离菌株在普通培养基NA上恢复培养，并在好氧条件下培养48小时。选取单菌落并在相同好氧孵育条件下重新划线至NA上。随后使用这些培养物制备冷冻保存菌种。这些分离菌株来源于采血时未经历肺部急性加重的男女患者的痰液样本。

将冷冻保存菌种划线接种至Mueller-Hinton琼脂平板上，从分离的菌落中接种过夜培养。18小时后，使用Zymo Fungal/Bacterial DNA Miniprep Kit（Zymo Research Corporation，美国加州尔湾）从这些分离菌株中提取基因组DNA。使用NanoDrop OneC微量紫外-可见分光光度计评估提取DNA的浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳验证。样本提交至SeqCenter（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）使用Illumina平台进行全基因组测序。此外，使用Zymo BIOMICS DNA Miniprep进行DNA提取。Illumina DNA Prep Kit（标记化后接PCR扩增）用于文库制备和原始reads的测序，生成2 × 151 bp的双向读数。质量控制和接头修剪使用bcl-convert（v4.1.5）进行，短读长组装使用Unicycler（v 0.4.8）完成（6, 7）。使用QUAST（v5.0.2）和CheckM（1.2.0）进行组装统计（8, 9）。使用Bakta（v1.7.0）进行样本注释（10）。注释由美国国家生物技术信息中心（NCBI）完成。使用mlst（v 2.23.0）对基因组进行多位点序列分型（MLST）（11）。

为了验证分类学，使用GTDB-Tk（v1.3.0）和r95数据库生成120个单拷贝蛋白的拼接比对。提取葡萄球菌属和葡萄球菌属A组基因组，以及大肠杆菌外群基因组，并使用FastTree（v2.1.10 SSE3）构建最大似然系统发育树。使用GTDB-Tk（v1.3.0）生成120个单拷贝蛋白的拼接比对（12）。提取葡萄球菌属和葡萄球菌属A组基因组，以及大肠杆菌外群基因组，并使用FastTree（v2.1.10 SSE3）构建最大似然系统发育树（13），图1。该树以大肠杆菌为外群进行定根，并在iTL中可视化（14）。所有程序均使用默认参数。最终组装统计数据见表表1。

图1

图1 系统发育树。基于葡萄球菌属120个单拷贝拼接蛋白构建的最大似然系统发育树。新分离菌株以蓝色显示。该树以大肠杆菌为外群进行定根。比例尺代表每位的平均氨基酸替代率。

表1

表1 分析菌株的基因组组装统计数据和登录信息

参数	数值
菌株名称	RWOK-1A	RWOK-1B	NDOK-1B	RNOK-3	RNOK-4	RNOK-5
总reads数（R1 + R2）	9,244,460	15,453,168	18,509,532	18,470,134	16,589,702	15,682,660
总大小（Mbp）	2.80	2.80	2.82	2.77	2.80	2.84
覆盖率	447	719	853	857	767	720
contigs数量	38	41	35	39	42	38
N50（Kbp）	279,593	279,593	222,014	398,562	219,923	224,889
L50	3	3	4	3	4	3
GC含量（%）	32.75	32.75	32.78	32.77	32.71	32.77
完整度（%）	99.51	99.51	99.51	99.23	99.51	99.51
多位点序列型（ST）	ST5	ST5	ST5	ST5	ST5	ST225
NCBI BioSample	SAMN60251906	SAMN60251907	SAMN60251909	SAMN60251910	SAMN60251911	SAMN60251912
NCBI 登录号	JBYMTW000000000	JBYMTX000000000	JBYMTZ000000000	JBYMUA000000000	JBYMUB000000000	JBYMUC000000000
生物名称	金黄色葡萄球菌 RWOK-1A 5814FPM1	金黄色葡萄球菌 RWOK-1B 5814FPM5	金黄色葡萄球菌 NDOK-1B 61214B	金黄色葡萄球菌 RNOK-3 6514A	金黄色葡萄球菌 RNOK-4 7314A	金黄色葡萄球菌 RNOK-5 8714C
NCBI BioProject	PRJNA1467672

致谢

本研究由研究资助项目2R15GM124670支持。