基于Diels-Alder反应和逆电子需求Diels-Alder反应点击化学制备的可注射透明质酸水凝胶用于药物递送：体外与体内的对比评估

《International Journal of Biological Macromolecules》：Injectable hyaluronic acid hydrogels via Diels-Alder and inverse electron demand Diels-Alder click chemistry for drug delivery: A comparative in vitro and in vivo evaluation

　　

-评估了两种用于靶向药物递送的生物正交透明质酸水凝胶。
-IEDDA系统在约320秒内交联，远快于DA凝胶所需的约1080秒。
-IEDDA网络在体内维持结构完整性并使染料保留时间更长，优于DA对应物。
-研究结果证明，点击化学的选择直接决定了水凝胶的网络架构和生物降解特性。

引言
尽管手术、化疗、免疫治疗和放射治疗等治疗方法不断改进，但癌症病例和死亡人数仍在持续增加，癌症仍然是全球性的重大健康挑战。癌症病例的不断增长表明需要新的、有效的癌症治疗方法[1]。根据目前的预测，美国在2025年将有2,041,910例新发癌症病例和618,120例癌症死亡[2]。目前的全身化疗方法面临各种生理屏障，这些屏障阻止了大部分治疗剂量到达实体瘤，并给肿瘤靶向带来挑战，同时产生在预期治疗部位之外发生的严重副作用。局部药物递送方法通过利用生物材料在植入部位持续释放治疗物质，建立了一种成功的治疗策略，能够在肿瘤处达到治疗浓度，同时减少全身暴露和毒性作用[3]、[4]。各种可生物降解的局部递送平台，如纤维膜[5]、网[6]、支架[7]和水凝胶[8]，能够产生独特的药物释放模式，减少脱靶毒性，提供可调节和持续的释放曲线，并在联合疗法直接给药于早期肿瘤时提高治疗效率[9]。

水凝胶是三维聚合物网络，是一种高度多功能的局部药物递送材料，其可调结构可实现定制化的溶胀、生物降解性、粘附性、机械强度、环境响应性和载药/释药行为，同时还能保留大量水分，包封多种治疗剂，并模拟天然细胞外基质的特性[10]、[11]。水凝胶可以通过物理相互作用或更强的共价化学交联形成，后者为生物医学应用提供了更优越的稳定性与机械性能[12]。在化学方法中，点击化学反应，如Diels Alder反应(DA)[13]、逆电子需求Diels Alder反应(IEDDA)[14]、硫醇-烯/硫醇-炔偶联反应、铜催化的叠氮-炔环加成反应(CuAAC)[15]，在温和条件下提供快速、选择性高、高产率的交联，使其在设计用于局部药物递送应用的水凝胶方面极具吸引力[15]、[16]。

可注射水凝胶是一类先进的水凝胶生物材料，由柔软的、富含水分的、三维聚合物网络组成，可以微创的液体形式给药，随后在靶部位的生理条件下发生凝胶化。这种原位凝胶化能力减少了外科植入的需要，增强了局部药物递送，减少了药物的过早泄漏，限制了全身副作用，并改善了患者的舒适度和依从性[17]、[18]。可注射水凝胶的最佳药物剂量和释放动力学根据癌症类型、肿瘤微环境和治疗策略而显著不同。因此，可注射水凝胶可以使用各种点击交联化学进行设计，包括CuAAC、应变促进的叠氮-炔环加成反应(SPAAC)、硫醇-烯反应、DA反应和IEDDA反应，以满足特定生物医学应用的独特药代动力学和机械性能要求。然而，每种化学方法都存在某些局限性。例如，CuAAC可能引起铜相关的细胞毒性[19]，硫醇-烯系统可能产生氧化副反应和光引发剂相关的细胞损伤[20]，而SPAAC反应通常涉及疏水性的环辛炔衍生物，这可能会对水凝胶的均一性和生物相容性产生负面影响[21]。相比之下，基于DA和IEDDA的交联策略在温和反应条件下对水凝胶网络形成、降解行为和刺激响应特性提供了更优越的控制。因此，可注射水凝胶的溶胀特性和药物释放曲线可以根据特定肿瘤状况的治疗需求进行精确定制。

DA环加成反应使科学家能够通过一种无需催化剂并在温和水性条件下工作的生物正交方法创建共价交联的水凝胶，这允许快速凝胶化，同时保持嵌入药物的治疗特性[22]、[23]。研究人员发现，通过DA交联的聚合物网络可以调节以实现适当的机械性能、自修复能力和可控降解，使其适用于药物递送系统和组织工程应用[13]、[24]、[25]、[26]。DA化学的现状存在一些实际局限性，因为某些单体对需要高温且反应速率较慢，这限制了其在各种生物医学应用中的使用[27]。基于四嗪的IEDDA点击反应提供快速、无催化剂的动力学，同时具有生物正交性能及其在温和生理条件下工作的能力。由于这些特性，这种反应成为生产聚合物水凝胶的有力方法，允许掺入生物活性分子、表面图案化和开发可调节的网络特性，这对现代生物医学应用至关重要[14]、[28]。IEDDA反应在交联过程中释放氮气(N?)，导致水凝胶内产生气泡并形成多孔网络结构[29]。这种多孔网络促进了质量传输，改善了营养扩散，并增强了对载药和释药的控制，从而在药物递送应用中提供了多种优势[30]。

许多研究证明了通过DA反应制备的水凝胶的优势，然而，大多数报道的系统需要相对较高的温度才能实现有效凝胶化[31]、[32]。相比之下，基于IEDDA的水凝胶以其在温和生理条件下的超快凝胶化动力学而广为人知[33]。尽管有这些进展，但尚未报道对相同聚合物骨架制备的DA和IEDDA水凝胶在生理温度(37°C)下的直接比较研究。为了弥补这一空白，我们假设在生理条件下使用DA和IEDDA点击化学制备的HA基可注射水凝胶将表现出不同的物理化学和生物学特性。本研究不是比较两个系统在相同网络参数下的表现，而是考虑各自点击化学平台的影响，包括它们的反应动力学、聚合物功能化和由此产生的网络特性，对水凝胶性能的影响。特别是，这些因素预计会影响气泡形成、溶胀行为、新鲜制备(湿)水凝胶的药物释放以及体内表现。为了研究这些关系，设计并系统地评估了两种HA基可注射水凝胶系统，以比较其基于各自的DA和IEDDA网络形成的物理化学性质和生物学反应。

HA是一种天然存在的糖胺聚糖，以其卓越的生物相容性、生物降解性和高保水能力而闻名，使其成为广泛生物医学应用的理想支架材料[34]。此外，其粘弹性和剪切变稀特性，以及通过化学修饰支持细胞粘附的能力[35]、[36]，促进了HA基水凝胶、伤口敷料和用于组织工程、伤口愈合和靶向治疗递送的可注射系统的发展[37]。

为此，使用4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)介导的偶联化学对HA进行功能化，引入降冰片烯(HA-Nb)和呋喃(HA-Fu)基团，分别产生与IEDDA和DA点击反应兼容的聚合物前体。在HA-Nb系统中，取代度约为30%，而HA-Fu设计为相对较高的呋喃取代度(>50%)，以促进在生理温度下高效形成DA水凝胶。这些功能化差异与两种点击化学系统不同的反应动力学和网络特性相关联。使用这些HA-Nb和HA-Fu前体，通过分别与四嗪封端的聚乙二醇(PEG-DTz)和马来酰亚胺封端的聚乙二醇(PEG-DMal)连接子交联，在生理条件下快速形成IEDDA和DA水凝胶，产生适合可注射应用的快速凝胶化动力学(方案1)。为了阐明两种水凝胶系统的功能特性，进行了全面分析，包括流变学表征、基于扫描电子显微镜(SEM)的微结构分析、与IEDDA系统中气泡形成相关的体积变化测量、溶胀和药物释放研究以及体内性能评估。结果表明，DA和IEDDA基水凝胶在凝胶化行为、溶胀、形态、释放动力学和体内表现方面存在明显差异。这些发现提供了比较理解，即不同的点击化学平台及其相关网络特性如何影响可注射HA水凝胶的结构和功能性能，用于生物医学应用。

片段材料
HA(700 kDa, Hyundaibioland)，5-降冰片烯-2-甲基胺(Nb-NH?, 98%, TCI)，糠胺(Fu-NH?, 98%, TCI)，4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM, TCI)，4-(二甲氨基)吡啶(DMAP, 99%, TCI)，(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl, 99%, TCI)，戊二酸酐(95%, Sigma Aldrich)，甲酰胺胍乙酸(99%, TCI)，三氟甲磺酸锌(TCI)，三乙胺(TEA, 99.5%, Sigma Aldrich)，4-(氨基甲基)苯甲腈盐酸盐(97%, Sigma

HA-Nb的合成：
通过DMTMM介导的偶联化学在MES缓冲液中将HA与Nb-NH?功能化，产生HA-Nb。通过D?O中的1H NMR光谱确认了HA-Nb的化学结构(图2A)。在5.9-6.4 ppm处观察到的峰归因于Nb基团的烯烃质子[14]，而HA的特征甲基质子峰出现在2.0 ppm处。通过HA质子的积分比计算，取代度确定为约30%。

结论
本研究比较了使用两种不同的生物正交点击反应形成的HA水凝胶，即呋喃-马来酰亚胺DA和四嗪-降冰片烯IEDDA，以阐明它们在凝胶化、网络特性、药物释放和降解行为方面的差异。通过NMR确认了HA-Nb、HA-Fu和PEG-DTz的成功合成。IEDDA水凝胶表现出比DA水凝胶快得多的凝胶化，流变分析显示凝胶化时间约为5分钟，管

CRediT作者贡献声明
Urwa Shahid：撰写 – 初稿，软件，方法学，正式分析，概念化。Seon-Hwa Kim：撰写 – 初稿，软件，方法学，正式分析。Israr Ali：方法学，正式分析，概念化。Ganghak Lee：可视化，正式分析，数据管理。Suganthy Ramamoorthy：可视化，正式分析，数据管理。Sung-Han Jo：调查，正式分析。Iman Janghorban Esfahani：验证，调查，正式分析。Kai-Chiang Yang：

利益冲突声明
作者声明没有可能影响本工作的财务利益或个人关系。

致谢
本工作得到韩国国家研究基金会(NRF)由韩国政府(MSIT; NRF-2023R1A2C1002954和RS-2025-02213559)资助的支持，通过釜山广域市区域创新系统与教育研究所的RISE计划(MOE和釜山广域市; 2025-RISE-02-001-057)，以及浦项科技大学全球联合研究计划(202506830001)的支持。

Urwa Shahid|Seon-Hwa Kim|Israr Ali|Ganghak Lee|Suganthy Ramamoorthy|Sung-Han Jo|Iman Janghorban Esfahani|Kai-Chiang Yang|Sang-Hyug Park|Kwon Taek Lim