由热、芦丁和转谷氨酰胺酶诱导的小麦蛋白膜中的结构-功能调控及大分子相互作用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Structural-functional modulation and macromolecular interactions in buckwheat protein films induced by heat, rutin, and transglutaminase

　　**摘要**
热能处理、转谷氨酰胺酶引起的酶促交联以及多酚与芦丁的相互作用改变了荞麦蛋白（BWP）的大分子结构和功能特性。本研究以薄膜形成作为模型系统，评估了结构与功能之间的关系。通过等电点沉淀获得BWP，并在25°C、50%相对湿度（RH）条件下进行处理。采用标准方法评估了水蒸气透过率（WVP）以及机械性能、微观结构、物理和理化性质。通过基质重组、酶促交联和蛋白-酚类相互作用形成的疏水屏障使WVP降低了1.09%–43.92%，并提高了拉伸强度（TS）（p < 0.05）。加热处理对TS的影响最为显著（增加了57.88%，达到7.23 MPa）。处理后的薄膜亮度（L*）和黄度（b*）有所改善，而热处理显著降低了不透明度。含1%转谷氨酰胺酶的薄膜具有最高的时间依赖性吸湿能力。芦丁和转谷氨酰胺酶处理的BWP薄膜的抗氧化潜能提高了9.17%–15.34%（以Trolox抗氧化当量计）。 ninhydrin测定表明1%转谷氨酰胺酶浓度下交联效果最佳，更高浓度则表明交联已达到饱和。加热处理、芦丁处理和转谷氨酰胺酶处理的BWP薄膜的结构完整性和致密性逐步提高。含2%芦丁和1%转谷氨酰胺酶的薄膜表现出最佳的凝聚性和均匀性，这得益于WVP的降低和TS的提高。FTIR分析显示，热处理、芦丁处理和转谷氨酰胺酶处理改变了蛋白质的氢键和构象，从而增强了BWP薄膜的生物功能性、机械性能和阻隔性能，使其适用于可持续食品包装。

**引言**
荞麦因其食品价值和营养价值而备受青睐，更重要的是它不含麸质[1]。荞麦籽粒富含D-手性肌醇、维生素和多酚等营养成分[2]，这些成分具有抗炎、抗癌、降血压、降血糖和抗氧化等健康益处[3][4]。人们对荞麦蛋白的兴趣日益增加，因为其氨基酸组成非常均衡，包含所有必需氨基酸（9种），使其成为高质量的植物蛋白。Zhu[1]报告称，其近似组成与谷物相似，含有70%的淀粉、3%的脂质、10%的膳食纤维和2.5%的灰分。荞麦蛋白（BWP）可用于食品应用和可食用薄膜包装[1]。荞麦蛋白分离物和肽类具有降胆固醇、抗肿瘤、降压、预防心血管疾病、调节免疫系统、抗菌和抗氧化等作用[1][5]。除了不含麸质外，由于其高质量的蛋白质、生物活性化合物和有价值的膳食纤维，荞麦在功能性食品包装或可食用包装方面相较于小麦、玉米和水稻具有明显优势[5]。有研究表明，BWP具有良好的成膜能力，但在耐水性方面存在不足[1]。然而，添加功能性成分（如芦丁、转谷氨酰胺酶）或进行热处理可以改善BWP薄膜的生物、理化和微观结构性能。

**芦丁**
芦丁是一种存在于植物中的次生代谢物，化学名为3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮-3-芦丁苷或槲皮素-3-O-芦丁苷[6]。它是一种低分子量的天然多酚化合物，存在于荞麦、茶叶、苹果和柑橘类水果中。作为一种黄酮苷类化合物，芦丁具有抗氧化、抗癌和抗炎作用[6][7]。在多个国家，芦丁已被用作食品补充剂，美国食品药品监督管理局（FDA）建议每日摄入量为2克[8]，可通过口服、静脉注射或外用方式服用[8]。Li和Girard[9]指出，多酚和蛋白质通过蛋白质的疏水基团与多酚芳香环的相互作用形成氢键。芦丁-蛋白质复合物的形成可通过增强抗氧化功能来改善薄膜的品质。多种机制（如蛋白质的局部和三维构象变化）促进了这一效果，包括氢键、蛋白质与芦丁分子之间的疏水相互作用、芦丁的稳定化以及蛋白质与芦丁之间的协同抗氧化作用，从而形成更有效的抗氧化系统[10]。研究还表明，原花青素（一种多酚）主要通过非共价键与乳清蛋白形成复合物，共价键的形成程度取决于加工条件[9]。这些相互作用会改变蛋白质结构、颗粒大小和功能特性，强调了加工条件在形成蛋白质-多酚复合物系统中的重要性。

**转谷氨酰胺酶（TGase）**
转谷氨酰胺酶（TGase）是一种交联酶，可催化蛋白质分子中谷氨酰胺和赖氨酸残基之间的共价异肽键的形成，从而增强蛋白质网络结构和交联密度[11]。酶促交联可提高基于蛋白质的薄膜的机械强度、弹性和阻隔性能，使其更适合食品包装应用[12]。特别是经TGase处理的乳清蛋白薄膜被证明可以降低WVP并提高TS[13][14]，大豆蛋白薄膜也是如此[13][15]。Kang等人[16][17][18]的研究表明，TGase介导的交联可增强某些基于蛋白质的薄膜的耐湿性、柔韧性和微观结构致密性。这些研究表明，食品级TGase能有效提升基于蛋白质的可食用薄膜的生物功能。

**温度的影响**
温度是影响食品中化学反应速率的重要因素[19]。热处理是一种热处理工艺，可为蛋白质分子提供动能，增加分子运动并破坏稳定的非共价相互作用（如疏水相互作用、氢键和静电相互作用），从而暴露出隐藏的功能基团[19]。这些结构变化促进了分子间的相互作用、聚集和薄膜网络的形成，最终影响基于蛋白质的薄膜的功能特性[19]。Akter等人[20]指出，热处理可以在70–100°C下对乳清蛋白成膜溶液进行5–20分钟的热处理，但对BWP无影响[21][22]。热能会导致蛋白质结构的部分变性和疏水基团及巯基的暴露，从而促进更强的分子间相互作用（如二硫键和氢键的形成[21][22]。这些反应有助于形成更有序、更致密的基质和分子重组，提高薄膜的拉伸强度并降低WVP[20]。相关研究显示，在60–80°C下对大豆蛋白成膜溶液和薄膜进行2–6小时的热处理[20][23]以及乳清蛋白薄膜[24]，可改善其机械完整性和阻隔性能。热处理可通过硫醇-二硫键交换反应诱导分子间和分子内的二硫键形成[20][23]，从而使薄膜的拉伸强度提高1.8倍（达到3.49 MPa）[20]。因此，适当的热处理可以提升基于蛋白质的薄膜的结构网络和整体性能。

**可食用蛋白质基薄膜的研发进展**
目前，基于大豆、小麦、豌豆、葵花籽和 Zein 蛋白的薄膜材料已被广泛研究。然而，这些蛋白质在薄膜性能（如TS和耐水性）方面存在不足[25]。关于芦丁、热处理和转谷氨酰胺酶处理对BWP薄膜微观结构和功能特性的影响仍有限，相关研究数据尚不充分。本研究测试了热处理、芦丁加入和转谷氨酰胺酶（TGase）介导的交联如何共同作用，以调节蛋白质结构和薄膜功能。选择热处理是为了通过热能诱导蛋白质的部分展开，暴露反应性功能基团，并促进蛋白质基质内的分子间相互作用[20]。加热处理的BWP薄膜可能表现出更高的拉伸强度和更致密的结构。选择芦丁是因为它是一种具有抗氧化作用的植物来源多酚，可通过氢键和疏水相互作用与蛋白质结合，从而影响薄膜结构和功能[9][10]。BWP与芦丁和转谷氨酰胺酶在成膜溶液中的相互作用可能形成复合物和酶促交联[9][10][11][12]。TGase可催化蛋白质链间的共价异肽键形成，从而增强网络结构和稳定性[11][12]。因此，这些方法预期能提供不同的改进建议：热处理引起的蛋白质构象变化、芦丁支持的性能提升以及TGase网络增强。我们假设这些策略将调控热处理后的蛋白质、蛋白质-多酚和蛋白质-酶之间的相互作用，从而调节荞麦蛋白薄膜的结构和功能。

**研究方法**
使用Birkett Mills（美国纽约）提供的荞麦蛋白粉。Ajinomoto Health & Nutrition North America（美国伊塔斯卡）捐赠了微生物转谷氨酰胺酶（Activa STG-T1）。芦丁水合物（≥94%，HPLC级别）粉末、2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基铬烷-2-羧酸、没食子酸和Folin & Ciocalteu酚试剂购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。柑橘果胶购自Thermo Fisher。

**结果**
如图3所示，热处理、1%芦丁、2%芦丁和2%转谷氨酰胺酶处理均降低了BWP薄膜的WVP，但这些变化与对照组无显著差异（p > 0.05）。WVP衡量水蒸气通过薄膜的难易程度。薄膜基质中形成的疏水屏障越强，水蒸气的透过率降低得越明显，这可能归因于交联程度或大分子/植物化学物质的处理效果。

**结论**
本研究成功利用薄膜浇铸法制备了BWP薄膜。结果表明，热处理、芦丁处理和转谷氨酰胺酶处理分别以不同的方式和程度改善了BWP薄膜的结构和功能。SEM和FTIR结果提供了分子环境和薄膜形态变化的定性证据。从功能性能来看，薄膜表现出改善的机械性能和降低的水蒸气透过率。

**作者贡献声明**
Viola A.N. Nicholas-Okpara：撰写、审稿与编辑、原始草稿撰写、验证、方法论、研究设计、数据分析。
Ian Israelsen：方法论、数据分析。
Kristen Matak：研究设计。
Jacek Jaczynski：研究设计。
Ayesha Sarker：撰写、审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、方法论、数据分析、概念构思。

**伦理声明**
由于本研究未涉及任何人类或动物实验，因此不涉及人类和动物福利方面的声明。

**致谢**
本研究得到了美国农业部国家食品与农业研究所的Evans-Allen能力基金的支持。作者还感谢WVU共享研究设施提供的扫描电子显微镜和傅里叶变换红外光谱分析支持。