急性发热性疾病与亚急性中枢神经系统感染患者中人pegivirus的宏基因组恢复：印度尼西亚HPgV-2首次检测及HPgV-1 NS5A插入特征

《International Journal of Infectious Diseases》：Recovery of Human Pegiviruses from Patients with Acute Febrile Illness and Sub-acute Central Nervous System Infection

　　

高通量测序（HTS）技术随着测序成本下降和生物信息学工具日益可及，已显著推进感染性疾病诊断。宏基因组HTS的无偏性大幅增进了对健康与疾病状态下人类微生物群的认识。通过该途径常被鉴定出的病毒之一是人pegivirus 1（HPgV-1），旧称GB virus C或hepatitis G virus。HPgV-1为肝病毒科（Hepaciviridae）Pegivirus属的正链单股RNA病毒，已有报道与未分化急性发热性疾病（AFI）、神经系统疾病以及传染病暴发期间的共感染病毒相关。该病毒也常在合并人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、乙型肝炎病毒（HBV）或丙型肝炎病毒（HCV）感染的患者中被发现。值得注意的是，HPgV-1也常见于健康个体和献血者，因此其致病作用仍不确定。除HPgV-1外，人pegivirus 2（HPgV-2）于2015年被鉴定。HPgV-2全球遗传多样性有限，流行病学上与HCV共感染相关，尤其在具有肠外暴露风险的人群如注射吸毒者中。尽管HPgV-2与HCV具有结构相似性和传播途径，其似乎主要亲淋巴而非亲肝，尚未明确与特定临床疾病相关。HPgV-1此前已在印度尼西亚有记录，HPgV-2在东南亚如越南有报道；据研究人员所知，印度尼西亚尚无HPgV-2检测的发表报告。尽管全球HPgV-2报告仍稀少，本研究提供了HPgV-2在印度尼西亚检测的初步证据。本文描述两例pegivirus感染，包括通过基于HTS的筛查在既往未确诊的AFI和中枢神经系统（CNS）感染中检测到HPgV-1和HPgV-2。研究亮点包括：通过宏基因组下一代测序（mNGS）在AFI和CNS感染患者中鉴定HPgV-1；在印度尼西亚首次检测到HPgV-2，且一例CNS病例同时存在HPgV-1和HCV共感染；在HPgV-1基因组833-865位鉴定出NS5A 33-nt插入。

研究背景：高通量测序（HTS）成本下降和生物信息学工具可及，推动感染病诊断；宏基因组HTS的无偏性拓展了对人类微生物群的认识。HPgV-1为肝病毒科（Hepaciviridae）Pegivirus属正链单股RNA病毒，旧称GB virus C或hepatitis G virus，曾与未分化急性发热性疾病（AFI）、神经系统疾病及疫情中共感染相关，也常与HIV-1、HBV、HCV共感染，但健康个体和献血者亦常见，致病作用未定。HPgV-2于2015年发现，全球遗传多样性有限，流行病学上与HCV共感染相关，尤其注射吸毒等肠外暴露人群；与HCV结构相似和传播途径，但主要亲淋巴而非亲肝，未明确与特定临床疾病相关。HPgV-1在印度尼西亚已有报告，HPgV-2在东南亚如越南有报告，但印度尼西亚缺乏发表检测报告。因此研究人员通过基于HTS的筛查，在既往未诊断的AFI和CNS感染中描述两例pegivirus感染，以扩展印度尼西亚pegivirus基因组信息并记录HPgV-2循环。研究人员对两例标本行宏基因组高通量测序（mHTS），恢复两例完整HPgV-1基因组，并在病例2恢复完整HPgV-2和HCV基因组；遗传分析显示两株HPgV-1均属基因型4，病例2 HPgV-1含NS5A 33-nt插入（对应11氨基酸），HPgV-2为印度尼西亚首次检测。意义在于展示无偏宏基因组测序对常规诊断之外共循环病毒的基因组监测价值，并提示检测病毒需结合临床、影像和实验室结果解释。

关键技术方法：病例1血清来自巴厘Tabanan的646例AFI患者研究，发热后2天采集；病例2血浆和脑脊液（CSF）来自万隆346例疑似病毒性CNS感染队列中48例选做mHTS，依据标本可用性和测序资源，神经系统症状出现后不久采集。先行常规核酸扩增检测（NAAT）筛查alphaviruses、flaviviruses、enteroviruses、herpesviruses、paramyxoviruses，并以IgM抗体捕获酶联免疫吸附试验（MAC-ELISA）检测CHIKV、DENV、JEV IgM。RNA行mHTS，NextSeq 550平台；Geneious Assembler进行de novo组装，BLAST比对，重映射，最低3 reads深度生成共识；MAFFT v7.490比对，FastTree v2.1.12以GTR模型构建最大似然树。

研究结果：病例1（TBN450）为3岁男孩，2017年11月就诊于Tabanan General Hospital，高热39.6°C和不适2天，无其他表现或输血史；血常规含血小板正常，DENV NS1快速诊断阴性；初步诊断未分化AFI；血清NAAT alphaviruses和flaviviruses阴性；mHTS恢复完整HPgV-1基因组，覆盖99.4%（参考NC_001710.1），平均深度141 reads；与日本1997年前疑似病毒性肝炎患者variant 91.9%相似（AB003292）。病例2（IBIS2300693）为50岁男性，2022年7月就诊于Hasan Sadikin Hospital, Bandung, West Java，进行性行为改变和意识改变，格拉斯哥昏迷评分（GCS）10（E4V1M5）；嗜睡、颈强直、偏瘫、第3、6、7对颅神经麻痹；血常规和生化正常；抗-HCV和抗-CMV抗体阳性，HBsAg阴性；腰穿CSF清亮无细胞增多，蛋白94 mg/dL，CSF/blood glucose 0.49；India ink、隐球菌抗原、TB GeneXpert阴性；NAAT上述病毒阴性；血浆抗-CHIKV IgM阳性；脑磁共振成像（MRI）增强显示多灶病变提示进行性多灶性白质脑病（PML）伴ex-vacuo ventriculomegaly；4个月前诊断HIV-1并接受抗逆转录病毒治疗（ART，tenofovir/lamivudine/dolutegravir）；19天自动出院GCS 10、扩展格拉斯哥结局量表（GOSE）2，2月后心脏骤停死亡；无输血史。mHTS检测：病例2血浆完整HPgV-1（100%覆盖，平均深度3195 reads）、完整HPgV-2（99.8% vs NC_027998.2，平均402 reads）、完整HCV（100% vs NC_009824.1，平均4171 reads）；CSF低reads HPgV-1（10 reads）和HCV（9 reads），覆盖6.3%和9.9%，无CSF红细胞（RBC）计数等血液污染指标，不能确定鞘内感染或神经侵袭，可能反映腰穿血液污染。遗传比较与系统发育：TBN450最接近日本1997年前疑似病毒性肝炎variant（91.9%），IBIS2300693最接近泰国造血干细胞移植受者病毒（87.6%，MZ099568）；两印度尼西亚HPgV-1基因组仅88.6%相似；IBIS2300693在NS5A基因833-865位含33-nt插入（11氨基酸），TBN450无；按Feng等和Lee等分类（基因型4、6、7合并为基因型4），系统发育确认两variant均属基因型4。病例2 HCV最接近1996年前印度尼西亚variant D63821（91.4%），最大似然系统发育分类为基因型3k；HPgV-2最接近2004年美国variant KT427408（93.9%）。

讨论总结：HPgV-1致病作用仍不明确；病例1儿童很可能垂直传播，AFI症状未确立由HPgV-1所致，感染可能为mNGS偶然发现的持续感染。病例2疑似PML，但CSF JC病毒（JCV）DNA未检出（CSF非DNA病毒检测优化），ART后无临床改善，PML诊断不确定，神经诊断未解决；缺CD4⁺ T细胞计数和HIV病毒载量，难判断CNS恶化是否与免疫重建炎症综合征（IRIS）相关。HPgV-1在CNS作用不确定，CSF低水平reads更可能反映与HIV/HCV共感染共享传播途径或腰穿血液污染；检测到核酸不等于活跃复制、细胞侵袭或神经致病；需配对血/CSF、定量分子检测、病毒复制评估和可行时CNS组织分析。抗-CHIKV IgM阳性而CHIKV RNA未检出且表现不典型，可能为既往感染持续抗体或血清学交叉反应。NS5A 11氨基酸插入曾在免疫抑制儿童报告，功能意义不明。HPgV-2自2015年报道稀少，主要美国和中国，常与HCV共感染及注射吸毒/血液暴露；印度尼西亚首次报告；HPgV-1、HPgV-2、HCV共检测值得注意，HPgV-2流行病学和临床意义未明。mNGS可偶然检测无关病毒，HPgV-1检测应解释为感染基因组证据而非疾病因果。局限性：样本量小限制外推和选择偏倚；仅mHTS未用特异性NAAT确认；NAAT分析敏感性因缺限检测数据未定；横断面无纵向血清/分子随访，不能判断持续感染或短暂病毒血症；两例不能就临床关联或致病性定论。研究结论翻译：总之，对两名临床表现不同的印度尼西亚患者中HPgV-1和HPgV-2的宏基因组检测和基因组特征分析，扩展了印度尼西亚pegivirus多样性的可用基因组信息，并记录了HPgV-2在该国的循环。这些发现也证明无偏宏基因组测序用于基因组监测的价值，能够检测常规诊断目标之外的意外共循环病毒。因此，宏基因组测序是常规诊断调查的有用补充，但检测到的病毒必须结合临床、影像和实验室发现进行解释。需要进一步临床和病毒学研究以阐明人pegivirus的流行病学和致病意义。