负载 GDNF 的细菌纤维素 - 丝素蛋白 - 金纳米粒子导管用于周围神经再生：大鼠实验性坐骨神经损伤模型

《Injury》：Bacterial Cellulose-Sericin Gold Nanoparticle Conduit Functionalized with GDNF for Peripheral Nerve Regeneration: An Experimental Sciatic Nerve Injury Model in Rats

　　

# 摘要

## 目的

尽管自体神经移植物在周围神经损伤治疗中的应用仍被视为金标准，但有必要寻找替代性移植物材料。本研究旨在探讨一种经细菌纤维素（BC）膜修饰金纳米颗粒（AuNP）并以神经营养因子GDNF功能化处理的神经导管在周围神经损伤修复中的作用效果。

## 方法

本研究采用木醋杆菌（*Gluconacetobacter xylinus*）细胞培养获得细菌纤维素膜，经绿色合成法制备的丝胶蛋白-金纳米颗粒修饰，并以胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）功能化处理制成神经导管。在Wistar大鼠（n=21）中建立单侧坐骨神经8 mm缺损模型。大鼠分为三组：自体移植物组（n=7）、BC-AuNP组（n=7）和BC-AuNP/GDNF组（n=7）。第8周末进行步态分析和肌电图（EMG）测量。取坐骨神经组织进行组织学和免疫组织化学分析。

## 结果

第8周末结果表明，BC-AuNP/GDNF组通过步态分析和肌电图测量得出的坐骨功能指数达到与自体移植物组相当的水平。轴突直径、髓鞘厚度和血管计数的检测显示，自体移植物组和BC-AuNP/GDNF组的数值显著高于BC-AuNP组。

## 结论

在周围神经损伤的治疗中，BC-AuNP/GDNF的应用在功能和组织学方面均取得了与自体移植物相当的修复效果。

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# 引言

周围神经系统损伤是一个重要的公共卫生问题，其特征为感觉和运动神经向中枢神经系统传导通路的破坏。周围神经损伤影响2.8%的患者，导致严重的功能障碍，并产生超过70亿美元/年的社会经济成本[1]。创伤性周围神经损伤（PNI）主要由交通事故引起，其次为坠落或工伤等钝性或穿透性创伤[2]。周围神经损伤通常导致患者出现感觉运动功能丧失、慢性神经性疼痛、心理障碍和精神疾病，严重影响生活质量[3]。在技术上可行的情况下，无张力端端吻合是修复断裂周围神经的首选手术方法。然而，直接修复的适用性不能仅根据神经间隙的绝对长度来判断，还取决于解剖位置、神经活动度、局部组织状况以及吻合时产生的张力程度。吻合部位的过度张力可能损害神经内微循环，促进缺血和纤维化变化，从而损害轴突再生[4][5]。因此，当无法在不产生过度张力的情况下实现直接吻合时，应根据缺损特征、受累神经及临床情况选择适当的桥接策略，如自体神经移植物、处理过的神经同种异体移植物或神经导向导管[6][7]。传统治疗通常依赖自体感觉神经移植物或脱细胞神经同种异体移植物。其中，自体神经移植物是金标准，提供了包含雪旺细胞和细胞外基质的天然支架。然而，自体神经移植物的可用性和可及性有限，可能导致取植 morbidity、瘢痕形成、感觉丧失和神经瘤形成等问题。因此，在广泛损伤和供体神经不足的情况下，需要采用替代方法来增强功能恢复并减少并发症[8][9]。

为克服这些局限性，目前正在开发多种神经导管作为替代品，提供结构化的生物材料路径以引导轴突再生。用于周围神经损伤修复的神经导管具有多种功能。首先，它们保护神经末梢免受纤维组织侵袭；其内部微结构提供拓扑导向，从而促进神经有序再生。此外，这些导管还可以用生物活性因子（如生长因子）或细胞成分（如雪旺细胞）进行功能化处理，从而优化再生微环境以增强轴突再生和功能恢复[10]。

Mankavi等人在其研究中将神经导管分为三代。第一代和第二代神经导管仅设计用于桥接神经损伤间隙并在物理上引导轴突生长，但在临床研究中未能展现有效性。相比之下，第三代神经导管旨在更好地模拟天然神经微环境，强调精确复制细胞外基质（ECM）的形态和理化特性，从而提高治疗效果。为优化轴突再生能力，他们论证导管内神经组织的成分、结构和功能应进行仿生工程化，以重现天然神经环境的基本特征[11]。近期的一篇文献综述得出结论，具有临床疗效的理想神经导管材料必须满足三个关键参数：物理相容性、生化调节和生物电调节[12]。

细菌纤维素（BC）是一种具有可持续发展潜力的新兴生物聚合物，在生物医学领域具有重要应用前景。其独特的物理特性包括柔韧性、高孔隙率、高保水能力和纳米尺度尺寸。此外，其化学特性包括高结晶度、可折叠性、高纯度、高聚合度和易于修饰。BC还表现出可生物降解性、生物相容性和非生物降解性等生物学特征[13]。基于BC的复合材料因其与细胞外基质结构的相似性，被认为是实验性神经导管应用的有前途的候选材料。凭借这些特性，BC为功能化纳米颗粒的嵌入提供了最佳且组织相容性良好的支架。基质与纳米颗粒之间的协同作用促进了先进或新型功能纳米复合材料的开发[14]。

鉴于神经细胞负责电化学信号的传导，对设计生物材料表面进行的导电性修饰可以促进神经细胞的分化和发育。除了长期以来使用的导电聚合物外，利用金纳米颗粒（AuNPs）对支架表面进行功能化处理近期也引起了极大关注。AuNPs是具有优异理化性质的金属纳米颗粒[15][16]。然而，传统合成方法通常依赖于硼氢化钠等有害化学品，这些物质具有毒性风险，限制了其临床适用性。为应对这些挑战，近期研究致力于采用天然聚合物作为绿色合成方法，这些聚合物同时充当还原剂和稳定剂。这些生物聚合物不仅降低了纳米颗粒制造过程中相关的环境和生物危害，还增强了所得纳米颗粒在生理环境中的胶体稳定性和相容性[17]。在这些天然聚合物中，丝胶蛋白是一种从蚕茧中提取的亲水性蛋白质，因其丰富的氨基酸组成和固有的可生物降解性而成为一种特别有前景的候选材料[18]。丝胶蛋白中酪氨酸残基上的酚羟基促进金属离子的还原，从而在不使用额外有毒试剂的情况下原位形成稳定的金属纳米颗粒[19]。先前的研究已经证明丝胶蛋白能有效合成和稳定银纳米颗粒[20]。本研究采用绿色合成策略合成了丝胶蛋白稳定的金纳米颗粒（Ser-Au）。这些Ser-Au纳米颗粒表现出增强的稳定性和生物相容性，使其成为递送治疗药物（特别是在对抗传统治疗因渗透性差和耐药机制而往往失效的生物膜相关感染方面）的有吸引力的纳米载体候选者。

GDNF是一种关键的神经营养因子，促进周围神经系统中神经元的存活、维护和再生。它在感觉、运动和自主亚型周围神经元的发育和功能中发挥重要作用。GDNF由雪旺细胞、肌细胞和靶组织合成，从而为损伤后的神经修复创造有利环境。该因子促进轴突生长，支持再髓鞘化，并抑制神经元凋亡[21]。此外，据报道GDNF负载导管不仅具有体内效应，还促进了细胞水平的再生过程，包括雪旺细胞增殖和迁移、氧化应激和凋亡的减少以及免疫微环境的调节。这些发现为"GDNF+载体"策略提供了机制支持[22]。

综合现有文献，本研究旨在探讨通过细菌纤维素膜修饰金纳米颗粒（BC-AuNP）并以神经营养因子GDNF功能化处理创建的第三代多功能神经导管在创伤性周围神经损伤病例中的潜在治疗效果。这种创新方法可以作为未来周围神经再生临床应用的新策略。

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# 材料

醋酸（MW = 60.05，纯度99.7%）购自VWR Chemicals。氢氧化钠（NaOH，d=40.00 g/mol）、戊二醛（25%水溶液）和显微镜用八氧化锇购自德国Merck KGaA。GDNF重组人蛋白（纯度>98%，10 μg）购自美国Sigma-Aldrich。Hepes游离酸（纯度>99.0%）购自Biomatik。家蚕茧购自Kozabirlik（土耳其布尔萨）。主要试剂包括……

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# Ser-AuNPs的光学表征（UV-Vis光谱法）

首先使用UV-Vis光谱法监测丝氨酸介导的金纳米颗粒（Ser-AuNPs）的形成和稳定性。如图3A所示，合成的Ser-AuNPs显示出清晰且明确的表面等离子体共振（SPR）吸收带，峰值（λmax）位于520 nm。该特定的SPR峰是直径在10至20 nm范围内的球形金纳米颗粒的典型特征。

将Ser-AuNPs与柠檬酸封端的对照组（Ctrl_AuNP_15nm）进行比较，两个样品显示出几乎相同的……

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# 讨论

本研究考察了由经金纳米颗粒（BC-AuNP）修饰并以神经营养因子GDNF功能化处理的细菌纤维素膜构成的导管在坐骨神经损伤模型中如何支持周围神经再生。将BC-AuNP和BC-AuNP/GDNF导管植入大鼠神经间隙中，并与金标准治疗——自体移植物进行全面比较评估。尽管自体移植物组仍然是表现最佳的……

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# 生成式AI及AI辅助技术在论文撰写过程中的声明

在本文撰写过程中，作者使用了Grammarly Word应用程序来提高语言的清晰度和正式性，并使用了ScholarLabs来辅助文献检索。在使用这些工具之后，作者根据需要审查和修改了内容，并对最终发表的文章承担全部责任。

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# 未引用参考文献

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# CRediT作者贡献声明

Ozlem Kirazli：撰写——审阅与编辑，验证，监督，资源，资金支持获取，概念化。Fatih Maral：撰写——初稿，方法学，调查研究，形式化分析，数据管理。Nermin Yasinoglu：撰写——初稿，方法学，调查研究，形式化分析，数据管理。Fatih Icbudak：资源，调查研究。Sezin Cevik：可视化，调查研究。Semra Unal：撰写——审阅与编辑，可视化，方法学，调查研究……

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# 利益冲突声明

作者声明以下可能与潜在利益冲突相关的财务利益/人际关系：

Ozlem Kirazli报告获得马尔马拉大学的资金支持。Ozlem Kirazli与马尔马拉大学存在雇佣关系。如有其他作者，他们声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或人际关系。

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# 致谢

本研究由马尔马拉大学科学研究委员会资助，协议编号为TDK-2024-11274。作者声明不存在利益冲突。

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**作者名单：**

Fatih Maral | Nermin Yasinoglu | Fatih Icbudak | Sezin Cevik | Semra Unal | Banu T. Karaca | Zeynep Akdeniz | Merve A. Elmas | Umit S. Sehirli | Yasin Arifoglu | Ozlem Kirazli