温度对含正磷酸三钠（TSP）或柠檬酸三钠（TSC）的高密度酪蛋白胶束（MC）悬浮液热诱导解离、聚集、凝胶化抑制与流变学的影响

《International Dairy Journal》：Impact of temperature on dense casein micelle suspensions in the presence of orthophosphate and citrate

　　

研究人员在 pH 5.8 和 pH 7.0 下，于两种熔融盐柠檬酸三钠（trisodium citrate, TSC）或磷酸三钠（trisodium phosphate, TSP）存在时，在较宽的熔融盐与酪蛋白重量比（R）范围内，考察了高温加热对高密度（14 wt%）胶束酪蛋白（micellar caseins, MC）悬浮液力学性能和微结构的影响。研究人员在较低 MC 浓度（3 wt%）下考察了加热对浊度的影响，结果表明由熔融盐添加诱导的胶束解离被加热加速。在较高 R 值下，加热诱导部分解离酪蛋白聚集，导致样品不均匀，可通过施加强剪切均质化。然而，在停止剪切后老化过程中，样品趋于再次变得不均匀。对于未加热样品，在 pH 7 下，TSP 存在时观察到的黏度随 R 变化的峰在加热后消失。在 pH 5.8 下，完整胶束获得的均匀热诱导凝胶化被添加 TSC 或 TSP 所抑制。

论文解读：牛奶中主要蛋白为酪蛋白，主要以球形胶束形式存在，含 α_S1-、α_S2-、β- 和 κ-酪蛋白，相对重量比例约为 4:1:3.5:1.5；这些胶束平均半径约 100 nm，摩尔质量接近 10⁸ g/mol，κ-酪蛋白形成稳定外层。胶束完整性依赖胶体磷酸钙（colloidal calcium phosphate, CCP）纳米簇，CCP 与部分酪蛋白结合并维持胶束稳定。密集胶束酪蛋白（micellar caseins, MC）悬浮液在临界温度（critical temperature, T_c）以上形成凝胶，T_c 随 pH 升高而增加，pH 大于 6.4 时可高于 100°C。Ca²⁺ 螯合剂抑制胶束凝胶化，而添加 CaCl₂ 可通过形成钙桥促进凝胶化。熔融盐（melting salts）可螯合 Ca²⁺ 并溶解 CCP，工业上用于加工干酪生产；已获准用于加工干酪的五类熔融盐包括 citrate、orthophosphate、polyphosphate、pyrophosphate 和 tartrate，其钙封存效率顺序为 tartrate < orthophosphate < citrate < pyrophosphate < polyphosphate。先前研究报道，柠檬酸三钠（trisodium citrate, TSC）在 pH 7 和 pH 5.8 下均可引起 MC 解离，解离酪蛋白重组成较小、体积更大的颗粒；在 pH 5.8 下，随 TSC 浓度增加，密集 MC 悬浮液黏度逐渐升高；在 pH 7 下，较小 TSC 浓度窄范围内出现显著黏度升高。正磷酸三钠（trisodium orthophosphate, TSP）也能螯合 Ca²⁺ 并诱导胶束解离，但效率低于 TSC，需更高浓度才能完全破坏胶束；较高浓度 TSP 随时间逐渐增加浊度，表明解离酪蛋白在老化中形成致密聚集体；TSP 与释放的 Ca²⁺ 可促进部分酪蛋白胶束交联，流变学显示形成弱凝胶并嵌入剩余解离胶束的密集悬浮液中。加工干酪制造涉及加热和机械剪切，多磷酸盐存在下密集 MC 悬浮液的热诱导凝胶化已有研究，但高密度和较低 pH 相关条件下加热对 MC 悬浮液的影响尚未被研究。因此，研究人员在 pH 5.8 和 pH 7.0 下，于广泛 TSC 或 TSP 浓度范围内，研究 14 wt% MC 悬浮液的力学性能和微结构，并在 3 wt% MC 下考察加热对浊度的影响；pH 5.8 与加工干酪制造相关，pH 7 用于比较。

关键技术方法（不超过250字）：样本来源方面，MC 粉末 Promilk 852B 由 Ingredia Functional（Arras, France）提供，含 82% w/w 蛋白，其中 92% w/w 为 MC；酪蛋白酸钠（sodium caseinate, SC）由 Epi Ingredients（Crejen, France）提供；TSC 由 S.A. Citrique Belge N.V 提供，TSP 由 ICL group（Ladenburg, Germany）提供。研究人员制备 21 wt% 蛋白储备液并在 50°C 搅拌过夜水化，蛋白浓度用 280 nm UV 吸收测定。加热在密封玻璃瓶水浴中进行，剪切用高速涡旋定期处理。主要技术包括浊度测量、共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察微结构，以及应力控制流变仪测定零剪切黏度、储能剪切模量（G′）和损耗剪切模量（G″）的频率依赖。

3.1 加热对含 TSC 的 MC 悬浮液浊度的影响：研究人员在 3 wt% MC、pH 5.8 或 pH 7 下，于 20、30、50 和 80°C 测定不同 R 时浊度比随时间变化。pH 7 无盐时胶束在 80°C 保持稳定，仅 5 h 后浊度弱降；pH 5.8 下 80°C 浊度急剧升高，源于 MC 凝胶化；50°C 出现弱渐进升高，提示 T_c 接近 50°C。TSC 通过螯合 Ca²⁺ 导致胶束解离并降低浊度；30°C 无明显差异，50 和 80°C 影响显著。pH 5.8 下，R≥0.1 的 TSC 在 80°C 抑制胶束凝胶化，即使 R=0.1 时胶束仍大体完整。较高 R 下，pH 5.8 的 R=0.15 和 0.3、pH 7 的 R=0.3、0.5 和 1 出现浊度渐进增加，由部分蛋白聚集引起并最终可见大蛋白絮凝物沉降；重复样品的时间依赖性变异较大。

3.2 加热对含 TSP 的 MC 悬浮液浊度的影响：TSP 同样可螯合 Ca²⁺ 并在 20°C 引起 MC 解离，但所需 R 高于 TSC。80°C 下 TSP 在 R=0.1 也抑制 pH 5.8 的临界凝胶化；在更大 R 时，TSP 引起浊度渐进增加，且强于 TSC，两个 pH 下均如此。蛋白聚集导致的浊度增加随 R 增加而系统性加快，温度较低时该聚集发生在更大 R。

3.3 80°C 加热对添加 TSC 的密集 MC 悬浮液结构的影响：研究人员对 14 wt% MC 不同 TSC 样品在 80°C 加热并拍照。pH 5.8 下，纯水和 R=0.02 样品快速形成完整胶束凝胶，倾斜不流动，长时间加热后凝胶收缩脱水；R=0.05 至 0.1 样品视觉仍为均匀液体；R=0.15 至 0.4 部分蛋白絮凝形成管底沉淀。pH 7 下，R≤0.05 样品加热中不演变，更高 TSC 浓度下蛋白聚集体沉降。强剪切定期涡旋可使多数样品视觉均匀，但 pH 7 下 R=0.08 至 0.2 仍异质；停止剪切后，pH 5.8 下 R≥0.15 样品再次缓慢形成沉淀。CLSM 显示剪切后悬浮液含小致密蛋白聚集体及柠檬酸钙晶体，R>0.15 时沉淀主要是这些晶体；pH 7 下 R=0.05 至 0.2 的大蛋白聚集体被剪切破碎，但仍大于 pH 5.8 下者，R=0.3 和 0.4 下蛋白聚集体更小并含柠檬酸钙晶体。

3.4 80°C 加热对添加 TSC 的密集 MC 悬浮液流变的影响：加热并剪切后的均匀悬浮液在 5 至 30°C 测定 G′ 和 G″ 频率依赖，并经时间-温度叠加得到主曲线；结果呈典型黏弹系统，高频弹性、低频黏性，低频 G′ 平台表明形成极低模量固体。减去 G_gel 后，不同 R 和 pH 的主曲线可用 G_hf 归一化 G′、G″，并以 τ_c 归一化频率，其中 τ_c=1/2πf_c，f_c 为 G′ 与 G″ 交叉频率，G_hf 为 f_c 处 G′ 的十倍。G_hf 不明显依赖温度，τ_c 随温度升高强烈下降。pH 5.8 下 G_hf 随 R 变化不明显，pH 7 下 G_hf 随 R 增加至 R≥0.3 接近 pH 5.8 值；pH 7 下 τ_c 在极小 TSC 量时强增，随 R 增加至 R≈0.3 降至与 pH 5.8 同数量级；低剪切黏度 η 趋势类似 τ_c。与未加热样品相比总体相同，但 pH 7 下 R=0.02 至 0.1 加热后 τ_c 和 η 系统性更低。G_gel 样品间变异大，趋势为不依赖 pH；未加热 TSC 悬浮液无低频平台模量，说明弱网络在加热期间形成。

3.5 80°C 加热对添加 TSP 的密集 MC 悬浮液结构的影响：pH 5.8 下，R≤0.1 快速形成均匀凝胶并随加热时间增加脱水收缩；R=0.15 形成弱均匀凝胶并强脱水收缩；R≥0.15 抑制完整胶束凝胶化，抑制所需 TSP 量远高于 TSC。R>0.15 时加热中悬浮液视觉异质。pH 7 下，R=0.05 至 0.1 异质，但 R≥0.15 即使长时间加热仍视觉均匀。定期强剪切加热时样品视觉均匀，但室温数天后再次异质。CLSM 显示 pH 5.8 下 R=0.2 在较大尺度异质，R=0.3 尤其 R=0.4 更均匀并含小致密域；pH 7 下 R=0.05 至 0.15 可见致密蛋白聚集体，更大 R 时均匀。

3.6 80°C 加热对添加 TSP 的密集 MC 悬浮液流变的影响：其动态力学行为与 TSC 体系定性相似，主曲线可叠加，但 G_gel 有时接近 G_hf，使叠加更不确定。G_hf 独立于 R，且 pH 5.8 和 pH 7 近似相同；两个 pH 下 τ_c 随 R 增加逐渐增加，η 趋势类似。加热和剪切不显著改变 G_hf，但使 R=0.02 至 0.1 间 τ_c 和 η 最大值消失，也使加热前较低 G_hf 消失。R>0.1 时 τ_c 和 η 随 R 增加，可能归因于离子强度增加。R=0.05 时黏度随时间测量显示，TSC 存在下黏度在 30°C 数小时内下降，TSP 需 50°C；TSP 在 80°C 数小时内使黏度峰消失，TSC 在 60 和 80°C 下降停滞。G_gel 在 pH 5.8 显著大于 pH 7；pH 5.8 加热后 G_gel 系统性更大，但 R>0.3 时可忽略；pH 7 加热通常不影响 G_gel，除 R=0.4 加热后变得可忽略。

讨论部分总结：先前工作表明，20°C 下添加 TSC 或 TSP 会因胶束解离而降低浊度；TSC 比 TSP 更有效螯合 Ca²⁺，故在更低 R 诱导解离。TSP 在 R>0.6 时浊度缓慢增加，表明解离胶束酪蛋白在老化中聚集，研究人员认为该聚集由 CCP 释放的 Ca²⁺ 诱导，因为酪蛋白在 Ca²⁺ 和正磷酸盐存在下会聚集。密集 MC 悬浮液在高 R 下离子强度高，可降低 Ca²⁺ 活度，可能使 CCP 溶解部分源于此而非仅 TSC 或 TSP 螯合；因此 3 wt% 下测得的 MC 溶解随 R 变化可能不同于 14 wt%，尤其 TSP 在更大 R 时才溶解。本研究发现，升温至 30°C 对胶束解离无显著影响，但 TSP 存在时后续聚集更快；解离和聚集速率随温度进一步升高而增加，TSC 存在下也发生但更慢，说明正磷酸盐在其中作用重要。50 和 80°C 无 TSP 或 TSC 时，pH 5.8 与 pH 7 因临界凝胶化而差异很大，添加 TSP 或 TSC 可抑制该现象。高 R 下解离酪蛋白聚集在 pH 5.8 和 pH 7 相似，但重复样品中浊度缓慢增加存在变异。80°C 加热中酪蛋白聚集快速导致视觉异质，强剪切可破碎大絮凝物使多数样品视觉均匀，但 20°C 老化数天后再次异质。其机械性能与未加热悬浮液相似，除 pH 7 下 TSP 存在时 R=0.02 至 0.1 的黏度峰消失，TSC 存在时峰降低但未消失。高黏度小 R 范围被推测由部分 Ca²⁺ 螯合后胶束溶胀或酪蛋白间吸引相互作用引起，老化中黏度降低归因于进一步解离或酪蛋白聚集体局部致密化。G_gel 在 TSP 存在下远大于 TSC，尤其 pH 5.8，最可能因正磷酸盐在释放 Ca²⁺ 存在下促进酪蛋白聚集；样品间 G_gel 变化大，说明剪切和加载流变仪后形成的网络结构与连接性差异强。与多磷酸盐不同，多磷酸盐形成低密度、分形聚集体，可在低浓度渗流成均匀凝胶；正磷酸盐形成致密聚集体，使系统在大长度尺度异质；TSC 诱导聚集较少，但聚集体也致密，抑制稳定均匀凝胶形成。本研究中加热期间蛋白聚集与 de Kort 等的报道似矛盾，后者发现添加 TSC 或 TSP 降低 120°C 热凝固时间，但其最大 R 仅为 0.04 和 0.02，可能 120°C 下完整胶束聚集被少量熔融盐抑制，从而延长凝固时间。

研究结论翻译：加热加速由添加 TSC 或 TSP 诱导的酪蛋白胶束解离。在较高熔融盐浓度下，加热引起部分解离酪蛋白聚集。CLSM 图像显示，加热期间形成大而致密聚集体，悬浮液宏观异质。施加强剪切将大聚集体破碎成较小聚集体，使大多数悬浮液视觉均匀；然而，室温数天内它们再次异质。除蛋白聚集体外，还观察到磷酸钙和柠檬酸钙微晶。流变测量显示，聚集体形成弱凝胶，嵌入解离酪蛋白的致密黏弹悬浮液中。该黏弹悬浮液行为接近相同条件下无 CCP 的酪蛋白酸钠，除 pH 7 下在较窄的相对低 TSC 和 TSP 浓度范围内观察到黏度强增。流变行为受加热影响不大，除 TSC 存在下黏度峰降低、TSP 存在下完全消失。在 pH 5.8 下，完整胶束密集悬浮液在临界温度以上形成均匀凝胶，但该凝胶化过程被添加 TSC 或 TSP 抑制。作者为 Elie Matta、Peggy Thomar、Angella V. Dominguez、Christophe Chassenieux 和 Taco Nicolai。