超声辅助自由基接枝芝麻酚与乳清分离蛋白：结构修饰、功能增强与抗氧化特性

《Food Chemistry: X》：Ultrasound-assisted free radical grafting of sesamol onto whey protein isolate: Structural modifications, functional enhancements, and antioxidant properties

　　

研究人员采用超声辅助自由基接枝法（ultrasound-assisted free radical grafting）制备了乳清分离蛋白（whey protein isolate, WPI）-芝麻酚（sesamol）共轭物。芝麻酚的共价结合（covalent conjugation）改善了共轭物的结晶度（crystallinity）。分子对接（molecular docking）结果显示，氢键（H-bonds）和疏水相互作用（hydrophobic interactions）是维持复合物的非共价作用力。超声辅助接枝提高了共轭物的溶解度（solubility）和乳化特性（emulsifying properties），并增强了乳清分离蛋白的抗氧化活性（antioxidant activity）。

乳清蛋白（whey protein isolate, WPI）是牛乳中的主要蛋白质，具有高营养价值和多种功能特性，但在加工中易因pH、离子强度、温度等变化而聚集和溶解度降低，限制了其单独应用。多酚-蛋白接枝是增强蛋白质功能特性的有效策略，共价结合不可逆地改变结构，在多种环境应力下保持稳定性。自由基介导接枝法成本低、无毒，优于碱性和酶法。芝麻酚是芝麻来源的天然多酚木质素，具有抗氧化、抗炎等活性，但水溶性低、易降解。超声技术可促进蛋白质展开并加速与多酚的接枝反应。然而，传统自由基法需要24小时反应，严重限制工业规模化，且超声辅助自由基接枝在WPI-芝麻酚体系中的应用尚未见报道。为此，本研究系统评价了超声辅助自由基接枝法制备WPI-芝麻酚共轭物的结构、功能和抗氧化特性。

研究人员采用超声辅助自由基接枝法（240 W、40 kHz）制备了不同超声时间（30、60、90、120分钟）的共轭物（U/WPI-SE-30/60/90/120），并以传统自由基法（24小时）制备的C/WPI-SE和未加芝麻酚的WPI为对照。结果表明，超声90分钟的结合当量（4.65 mg/g）与传统法24小时（4.68 mg/g）相当，说明超声可缩短反应时间。接枝导致活性巯基和游离氨基减少，FTIR和XRD显示蛋白质二级结构变化和有序性增加，表面疏水性先增后降，分子对接预测氢键和疏水相互作用，粒径增大但ζ电位绝对值升高，溶解度、乳化性和抗氧化活性（DPPH和ABTS清除率）均增强。该研究提供了一种高效制备蛋白-多酚共轭物的策略，可用于稳定乳液和包埋生物活性物质。

关键技术方法：研究采用的关键技术方法包括：超声辅助自由基接枝制备共轭物；Folin-Ciocalteu比色法测定芝麻酚结合当量；DTNB法测定活性巯基；OPA法测定游离氨基；FTIR分析二级结构；XRD分析结晶度；ANS荧光探针测表面疏水性；MOE 2019分子对接；动态光散射测粒径和ζ电位；Biuret法测溶解度；浊度法测EAI和ESI；DPPH和ABTS法测抗氧化活性。样本来源：WPI（≥90%蛋白）由陕西BioColex有限公司（西安，中国）提供；芝麻酚等试剂购自上海源叶生物、麦克林生物、北京索莱宝等公司。

研究结果：
芝麻酚的结合能力：Folin-Ciocalteu法测得C/WPI-SE结合当量为4.68 mg/g，超声共轭物为4.48–4.73 mg/g，随超声时间增加而升高，90–120分钟与传统法无显著差异。超声的空化和机械作用促进自由基生成和蛋白质展开，从而加速反应；芝麻酚稳定的苯并二氧杂环结构使其不易被超声降解。
活性巯基和游离氨基：所有共轭物的活性巯基和游离氨基均较WPI显著下降，且超声时间越长下降越明显，表明芝麻酚与-SH和-NH2形成了共价键，超声使蛋白质展开暴露更多反应位点。
FTIR与XRD：FTIR中酰胺I和酰胺II带蓝移，α-螺旋和β-转角减少，β-折叠和无规卷曲增加，超声90/120分钟样品无规卷曲低于C/WPI-SE；XRD衍射峰强度增加，β-折叠峰向高2θ角移动，提示分子排列更有序。
表面疏水性：C/WPI-SE较WPI显著升高；超声样品随超声时间先升后降，与蛋白质展开暴露疏水基团及过量芝麻酚遮蔽有关。
分子对接：芝麻酚与β-乳球蛋白（-4.182 kcal/mol）和α-乳白蛋白（-3.586 kcal/mol）形成氢键（分别涉及Trp35和Asp83）及疏水相互作用（涉及多个Leu、Val、Tyr等残基），有助于共轭物稳定。
粒径与ζ电位：共轭物粒径较WPI（476.67 nm）增大，C/WPI-SE为669.00 nm，超声样品为547–638 nm；ζ电位绝对值均升高，超声样品（-16.1至-20.7 mV）高于C/WPI-SE（-14.2 mV），表明形成更大但胶体稳定的聚集体。
功能特性：所有共轭物溶解度均高于WPI（86.78%），超声60–120分钟（93.31%–95.27%）显著高于C/WPI-SE（89.62%）；共轭物的EAI和ESI均高于WPI，U/WPI-SE-120最佳。
抗氧化活性：WPI的DPPH和ABTS清除率分别为25.09%和45.61%；共轭物均显著提高，U/WPI-SE-120最高（48.92%和84.34%），优于C/WPI-SE（32.02%和82.43%），归因于酚羟基的引入和超声暴露的芳香族氨基酸。

在讨论部分，作者指出不同蛋白-多酚体系的结果差异与蛋白和多酚种类及反应条件有关；超声辅助方法通过增强多酚结合和结构展开，协同提高了蛋白质的功能和抗氧化性能。结论为：超声辅助自由基接枝可高效制备WPI-芝麻酚共轭物，90分钟达到与传统法24小时相当的结合量；共轭形成导致结构修饰，改善了溶解度、乳化性和抗氧化活性，未来建议用质谱进一步确认共价结合。该策略在食品工业中可用于稳定水包油乳液和封装生物活性化合物。