基于“人体到细胞”的自上而下策略发现靶向衰老与肥胖的生物可利用及生物活性天然化合物：从人血浆代谢物鉴定到细胞功能验证

《Food Chemistry》：Top-down strategy for discovering bioavailable and bioactive natural compounds targeting aging and obesity: A human-to-cellular investigation

　　

•研究人员应用了一种自上而下策略（top-down strategy），首先鉴定人血浆中的生物可利用化合物（bioavailable compounds），随后在细胞模型（cellular models）中研究其生物活性。
•该方法在评估生物活性前确保生物利用度，有助于提高可转化性。
•在摄入后的人血浆中鉴定出来自柠檬马鞭草（Lippia citriodora）、橄榄叶（Olea europaea）和水飞蓟（Silybum marianum）的六种主要代谢物。
•这些植物代谢物恢复了应激诱导衰老细胞（stress-induced senescent cells）的增殖。
•已鉴定化合物减少了肥大脂肪细胞（hypertrophic adipocytes）中的脂质蓄积。
•这些代谢物在细胞模型中调节了衰老关键标志物，如 SIRT1、Nrf2 和 LC3。

该研究论文发表在《Food Chemistry》。研究背景方面，天然产物长期用于疾病与健康紊乱治疗，并推动民族药理学和现代药物发现。然而，天然化合物研究曾因部分研究严谨性不足、材料表征不充分等被置于次要地位。当前衰老（aging）与肥胖（obesity）是公共卫生重大挑战，二者均与氧化应激和慢性炎症密切相关。自由基衰老理论（FRTA）认为，活性氧（ROS）导致蛋白质、脂质和DNA损伤；复制性衰老和应激诱导早熟性衰老（SIPS）伴随促炎细胞因子释放，形成衰老相关分泌表型（SASP）。肥胖中过度脂肪蓄积引起线粒体功能障碍和ROS过度产生，促进慢性炎症；氧化蛋白和脂质过氧化产物在内脏脂肪及肝脏、胰腺、心脏等器官蓄积，参与胰岛素抵抗和代谢综合征进展。部分天然化合物具有多靶点作用，可能调节相关细胞通路。柠檬马鞭草（Lippia citriodora）、橄榄叶（Olea europaea）和水飞蓟（Silybum marianum）提取物已在临床试验中显示抗氧化和抗炎活性。现有问题在于，传统自下而上方法通常先体外研究提取物或母体化合物活性，再外推至整体，不能保证生物利用度，且许多体外有效结果难以在体内重现。因此，研究人员采用自上而下“人体到细胞”策略，先鉴定人口服提取物后血浆中实际可生物利用的代谢物，再在细胞和计算机模型中评估其抗衰老与抗肥胖活性，以提高转化相关性，并为营养保健品或功能食品设计提供依据。

为开展研究，作者使用的主要关键技术方法如下：样本来自Elche University General Hospital伦理批准（reference PI 57/2019）的人体干预试验，共33名19—49岁志愿者，随机接受三种植物提取物或安慰剂，并进行系列血浆采样；采用高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间质谱（HPLC–ESI–QTOF–MS）进行血浆代谢物靶向注释；采用NONMEM非线性混合效应模型进行药代动力学分析；以3T3-L1细胞构建H₂O₂诱导SIPS成纤维细胞和高糖诱导肥大脂肪细胞模型；开展细胞计数与群体倍增水平（PDL）、实时增殖、β-半乳糖苷酶、ROS、甘油三酯和western blot检测；采用Trolox等价抗氧化能力（TEAC）和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）评估直接抗氧化活性；并进行分子对接模拟。该段约250字。

研究结果部分，3.1 人干预试验中提取物摄入后人血浆中检测到的主要代谢物：通过HPLC–ESI–QTOF–MS分析志愿者血浆，研究人员在柠檬马鞭草组主要检测到gardoside和verbascoside；在橄榄叶组检测到羟基酪醇及其硫酸、葡萄糖醛酸和葡萄糖苷结合物，以及oleuropein及其羟基化、硫酸化衍生物；在水飞蓟组检测到silybin及其硫酸和葡萄糖醛酸结合物，并检测到myricetin-3-O-D-glucoside。基于血浆丰度和商业可得性，选取verbascoside（VB）、gardoside（GD）、oleuropein（OL）、hydroxytyrosol 3-glucuronide（HT-g）、silybin（SL）和myricetin 3-glucoside（MR-g）进行后续研究。药代动力学显示这些化合物t_max多在0—2 h，支持采样期内鉴定主要代谢物。TEAC中SL最强，VB次之，OL再次；FRAP中VB最强，OL接近，SL也较强；GD直接抗氧化能力很低。微生物组分析未检测到门水平或α多样性指数对所选代谢物药代动力学或存在与否的影响。

3.2 所选代谢物在衰老成纤维细胞中恢复细胞增殖和氧化稳态并减弱衰老标志物：在H₂O₂诱导SIPS成纤维细胞中，通过Hoechst 33342染色、细胞计数、PDL计算、xCELLigence实时增殖、β-半乳糖苷酶染色、H₂DCF-DA ROS检测和western blot分析，研究人员发现，六种代谢物在不同剂量和时间点恢复衰老细胞增殖并降低β-半乳糖苷酶阳性细胞比例；GD恢复增殖最强，SL、VB、HT-g、OL和MR-g也显示作用。所有化合物在25 μM时将ROS降至与非衰老细胞相当，VB、OL和MR-g在较低剂量也有效。蛋白层面，所有化合物均降低Nrf2表达；除MR-g外，其余化合物升高SIRT1，OL最高；MR-g、OL和VB显著升高LC3。

3.3 代谢物减少肥大脂肪细胞中甘油三酯蓄积和ROS过度产生：在高糖诱导肥大脂肪细胞中，通过AdipoRed检测甘油三酯、H₂DCF-DA检测ROS和western blot分析，研究人员发现，所有化合物均显著降低甘油三酯蓄积，SL作用最强，VB和MR-g也明显；HT-g降低ROS最突出，SL和VB也显著降低ROS。Nrf2在MR-g和VB处理组显著升高；SIRT1在SL处理组升高最明显，OL和HT-g也显著升高；LC3仅OL显著升高。

3.4 与关键分子靶点的分子对接模拟：通过分子对接评估6种代谢物与AMPK、mTOR、JNK、NF-κB p105和p52亚基、MAPK14、组蛋白H2AX、IGF1和PARP1的相互作用，以ΔG≤?10 kcal/mol为强结合阈值。结果显示，强结合主要见于AMPK、mTOR、JNK、PARP1和NF-κB；MAPK14、组蛋白H2AX和IGF1结合较弱而被排除。silybin A和silybin B对AMPK位点1和2、mTOR、JNK、PARP1及NF-κB p105具有强结合，silybin A对NF-κB p52也有强结合；VB对AMPK位点1和2、mTOR、JNK和PARP1强结合；OL对AMPK位点1、JNK、PARP1和NF-κB p105强结合；MR-g对AMPK位点和JNK、PARP1强结合；GD仅对PARP1强结合；HT-g未显示强结合。

讨论部分，研究人员认为，自上而下策略优先考虑人体生物利用度，再进行功能筛选，可提高转化效率并降低成本，符合天然产物和膳食干预研究趋势。六种代谢物分别来自三种提取物，并在衰老和肥胖细胞模型中显示互补作用。VB可恢复增殖、降低β-半乳糖苷酶、降低ROS，并升高SIRT1和LC3，分子对接提示其与AMPK、mTOR、JNK和PARP1强结合；在脂肪细胞中VB降脂并升高Nrf2。GD恢复增殖最强，但直接抗氧化弱，升高SIRT1而不升高LC3，分子对接提示其与PARP1结合。OL作用延迟但可恢复增殖、降低β-半乳糖苷酶和ROS，升高SIRT1和LC3，并预测与AMPK、JNK、PARP1和NF-κB结合；在脂肪细胞中降脂并升高SIRT1和LC3。HT-g可恢复增殖、升高SIRT1并降低ROS，但无强分子对接靶点。SL抗衰老作用明显，预测结合靶点最多且亲和力强；在脂肪细胞中降脂最强，并显著升高SIRT1。MR-g降低β-半乳糖苷酶最明显，升高LC3，并在脂肪细胞中显著升高Nrf2、降低脂质和ROS。讨论也指出局限：细胞系有限，缺乏体内验证；未深入检测p16、p21、p53、SASP和DNA损伤标志物；LC3总表达不能证明自噬流，未来需检测LC3-II/I比值、p62周转和溶酶体抑制剂；分子对接需实验验证；单剂量设计限制重复给药推断；提取物中其他未检测化合物仍需考虑；细胞实验浓度与人体血浆浓度之间的直接相关性尚待研究。

研究结论部分翻译：该研究证明，来自柠檬马鞭草、橄榄叶和水飞蓟提取物的生物可利用代谢物对衰老和肥胖的关键细胞标志具有保护作用。在衰老成纤维细胞中，这些化合物恢复了增殖能力，降低了氧化应激，并减弱了过氧化氢诱导的早熟性衰老进程。在肥大脂肪细胞中，这些化合物显著降低了细胞内甘油三酯蓄积并调节氧化状态，提示其可抵消肥胖相关代谢紊乱。机制上，这些效应伴随SIRT1、Nrf2和LC3等细胞稳态关键蛋白的调节，并得到分子对接分析支持，提示其与能量代谢、氧化防御和应激反应通路存在推定相互作用。总体而言，这些发现突出了生物可利用植物来源代谢物调节氧化还原平衡和代谢功能的能力，提示其在延缓细胞衰老和改善脂肪细胞健康中的双重作用。然而，这些初步发现仍需在人体干预研究中进一步验证，之后才可能进行临床或商业转化。通过在功能评价前考虑化合物生物利用度，该自上而下方法旨在提高转化相关性，并可能帮助连接临床前与临床观察。这些初步发现支持所鉴定代谢物的潜在相关性，并可能为进一步探索靶向肥胖和衰老相关病理的营养保健品或功能成分提供依据。细胞结果提示，某些代谢物对衰老和肥胖标志表现出互补和潜在协同活性。来自L. citriodora的VB和GD恢复细胞增殖并抵消氧化应激诱导的衰老，提示其抗衰老调节相关性。来自O. europaea的OL和HT-g在脂肪细胞中发挥强抗氧化和降脂作用，支持其在肥胖管理和代谢调节中的潜力。来自S. marianum的SL进一步增强氧化还原平衡和细胞活力，而MR-g对衰老成纤维细胞提供额外保护。总之，柠檬马鞭草和橄榄叶提取物的合理组合似乎特别有效，因为其结合了抗衰老调节活性与显著抗氧化和抗脂肪生成作用。加入SL可增强氧化还原调节并提供更广泛的多效性益处。这种富含这些生物可利用代谢物的多组分制剂可能提供延缓细胞衰老和减轻代谢功能障碍的整体策略。未来研究应在对照干预试验中探索这些组合，评估潜在协同效应、最佳剂量及对肥胖和衰老相关结局的长期益处。