《Experimental Eye Research》：Otx2 directly regulates
tbx3 expression during early eye formation
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•LDN-193189 剂量依赖性地增加了眼区中 tbx3 的表达。•一个保守区域侧翼 tbx3，包含 9 个推定的已知眼基因结合位点。•保守的上游区域驱动转基因蝌蚪眼睛中 GFP 的表达。•Otx2 结合 tbx3 上游三个保守区域中的一个，直接激活 tbx3。引言在哺乳动
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LDN-193189 剂量依赖性地增加了眼区中 tbx3 的表达。
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一个保守区域侧翼 tbx3，包含 9 个推定的已知眼基因结合位点。
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保守的上游区域驱动转基因蝌蚪眼睛中 GFP 的表达。
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Otx2 结合 tbx3 上游三个保守区域中的一个，直接激活 tbx3。
引言
在哺乳动物发育过程中，眼睛形成始于视泡的突出及其向覆盖的表面外胚层延伸。接触后，视泡诱导表面外胚层增厚形成晶状体板，同时两个结构协调互相同步内陷：视泡向内折叠转变为双壁视杯，而晶状体板增厚并断裂成为晶状体泡。随着细胞增殖和分化，视杯内层成为神经视网膜，而外层形成视网膜色素上皮。随着发育进展，周围的神经嵴细胞和间充质迁移并分化为角膜、巩膜和葡萄膜，最终组装成成熟的哺乳动物眼睛高度特化的分层结构（综述见 Viczian 和 Zuber, 2014）。
视泡的建立依赖于原肠胚形成期间精确的时空信号传导。骨形态发生蛋白（BMP）拮抗剂，如 Chordin 和 Noggin，由胚泡 Chordin 和 Noggin 表达（BCNE）中心和斯佩曼组织者分泌（Kuroda et al., 2004），以抑制 BMP 和 Activin/Nodal/TGFβ 信号传导，从而将背侧外胚层指定为多能神经外胚层（综述见 Hemmati-Brivanlou 和 Melton, 1997）。在前额脑中，这种神经化组织形成眼区，由眼区转录因子（EFTFs）的表达定义，包括 Pax6、Tbx3、Rax、Six3、Lhx2、Nr2e1 和 Six6（Viczian 和 Zuber, 2014; Zuber et al., 2003）。虽然已知 Noggin 过表达足以诱导 EFTFs 表达并将多能原始外胚层指定为视网膜细胞（Wong et al., 2015; Zuber et al., 2003），但这些细胞外信号如何指导细胞内 EFTFs 表达仍不清楚。
Tbx3（最初鉴定为眼 T 盒，即 ET；Li et al., 1997）是在前神经板中表达的第一个 EFTF（Zuber et al., 2003）。我们此前已证明它作为 EFTF 基因调控网络的上游诱导因子起作用（Zuber et al., 2003），并且与 Pax6 一起足以决定视网膜命运（Motahari et al., 2016; Viczian et al., 2009）。在此背景下，Tbx3 转录抑制 BMP 信号传导并保护视网膜细胞能力。然而，将 BMP 抑制与 tbx3 激活联系起来的精确分子机制尚未阐明。
Orthodenticle Homeobox 2（Otx2）塑造前神经板并对大脑发育至关重要（Acampora et al., 1995; Acampora et al., 1997; Crossley et al., 2001; Gammill 和 Sive, 2000; Gammill 和 Sive, 2001; Kurokawa et al., 2004; Nishida et al., 2003; Pannese et al., 1995; Rhinn et al., 1998; Yasuoka et al., 2014）。我们此前观察到，在前神经外胚层中，Otx2 的表达先于 tbx3，并且当与 noggin RNA 共表达时，足以克服 Noggin 介导的抑制并在动物帽细胞中诱导 tbx3（Zuber et al., 2003）。在本报告中，我们通过鉴定 tbx3 基因周围的进化保守增强子区域（ECR）将这些发现联系起来。我们观察到上游区域可以驱动转基因蝌蚪眼睛中 GFP 的表达。我们还鉴定出这些进化保守增强子区域中的一个 Otx2 结合位点，并表明 Otx2 直接结合该区域以激活 tbx3 表达，这种机制被 Bmp4 或 ActivinB 抑制。总之，我们的发现闭环了调控环路，证明 tbx3 表达和早期眼睛形成是由 Otx2 介导的激活在 BMP 拮抗的允许控制下直接调控的。
章节片段
动物和抑制剂处理
Xenopus 胚胎通过体外受精获得，遵循 IACUC 批准的程序，并根据 Nieuwkoop 和 Faber 进行分期（Nieuwkoop 和 Faber, 1994）。对于动物帽分离，将 YFP RNA（500 pg）和实验 RNA 注射到二细胞期胚胎的两个细胞中。指定的 RNA 浓度是注射到每个细胞中的量。动物帽在第 8.5-9 期使用电凝尖端（Protech International Inc., Boerne, Texas）移除，并进行培养（有或没有
BMP 和 Activin 信号下调 tbx3 表达
早期眼区指定在 Xenopus 和培养的人视网膜类器官中需要抑制 BMP 信号传导（Lamba et al., 2006; Lan et al., 2009; Meyer et al., 2009; Viczian et al., 2009）。我们此前已证明，用 BMP 和 Activin 拮抗剂处理多能 Xenopus 细胞允许其整合到发育中的 Xenopus 眼睛中（Wong et al., 2015）。由于 Tbx3 位于 EFTF 级联上游，这里我们假设 tbx3 表达被 BMP
讨论
眼区指定是眼睛发育的关键步骤，但其早期诱导机制一直难以捉摸。我们此前表明，Noggin 通过抑制 BMP 诱导 tbx3 表达，触发下游眼区转录因子（EFTFs）级联（Zuber et al., 2003）。在本研究中，我们通过证明前神经板 tbx3 表达在 BMP 和 Activin 信号双重抑制下由 Otx2 直接激活，从而闭环了这一调控环路，将 Otx2
CRediT 作者贡献声明
Andrea Viczian： 撰写 – 审阅与编辑，项目管理，调查，资金获取，形式分析，数据整理，概念化。Jo?o Carlos Ribeiro-Silva： 撰写 – 审阅与编辑，调查
未引用参考文献
Declercq 和 Frank, 2013; Frank, 2013; Kumar P et al., 2014。
伦理声明
本研究按照 ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南进行。本研究经 IACUC 批准。
声明：AI 工具的使用
ASV 使用 Claude（版本 1.19367.0）改善摘要和图注中的语法，并缩短 Highlights 部分使用的陈述。作者审查并编辑了输出内容，并承担已发表文章内容的全部责任。
资金
这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01 EY033910 给予 ASV）、防盲研究基金会（部门无限制赠款）和 District 20-Y Lions Club 的拨款支持。JCR-S 由美国心脏协会（AHA.25POST1374112.pc.gr.227430" title="doi:10.58275/AHA.25POST1374112.pc.gr.227430">DOI:10.58275/AHA.25POST1374112.pc.gr.227430）的博士后奖学金支持。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这可能影响本文报道的工作。
致谢
我们感谢 Michael Zuber 和 Bill Brunken 对本项目提供的慷慨见解和鼓励。我们感谢 Karisa Rawlins 克隆本研究中制备的DNA构建体。
Jo?o Carlos Ribeiro-Silva|Kimberly.A. Wong|Andrea S. Viczian
