基于单细胞下一代基因组测序分析X连锁青少年视网膜劈裂症中视网膜DPP10表达的失调

《Experimental Eye Research》：Dysregulated Retinal DPP10 Expression with Single Cell-based Next Genomic Sequencing Profiling in X-linked Juvenile Retinoschisis

　　**要点**• 单细胞转录组分析揭示，视杆光感受器细胞是受RS1突变影响最为深远的视网膜细胞群体。• XLRS中的进行性视网膜退化与光感受器细胞和Müller胶质细胞中DPP10显著上调相关。• DPP10失调伴随着疾病进展过程中视网膜定位的改变和RS1表达的降低。• 细胞类型特异性转录组重塑凸显了XLRS视网膜中此前未被识别的分子反应。• XLRS患者循环DPP10水平升高，支持其作为疾病相关生物标志物的潜在转化应用价值。**引言**X-连锁青少年视网膜劈裂症（XLRS）是一种遗传性视网膜退行性疾病，影响全球约5000至25000名男性中的1名。该病的特征包括不同程度的中央视力损害、与黄斑劈裂相关的放射状条纹、外周视网膜分层分离，以及因b波振幅显著降低而导致的负向视网膜电图（ERG）模式。XLRS是由RS1基因突变所致，该基因编码视网膜分裂蛋白，一种分泌型胞外蛋白，在细胞黏附和细胞间相互作用中发挥关键作用，从而有助于维持视网膜结构组织和突触完整性。RS1功能的破坏导致结构紊乱、突触传递障碍以及视网膜结构的进行性退化。尽管RS1的结构功能已被充分阐明，但越来越多的证据表明，XLRS的发病机制涉及超越单纯视网膜结构力学破坏的多种因素。许多致病性突变位于RS1盘状域内，导致蛋白错误折叠、分泌障碍以及在内质网（ER）内积聚。这些异常被认为会诱导持续性内质网应激及未折叠蛋白反应（UPR）的激活，从而促进细胞功能障碍和凋亡。然而，RS1突变的下游分子效应，特别是涉及细胞类型特异性转录变化及应激反应信号通路的部分，尚未得到充分阐明。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的最新进展使得能够对复杂组织（包括视网膜）的细胞异质性和转录动态进行高分辨率分析。这些方法通过界定主要的神经元和胶质细胞群体、建立稳健的细胞类型特异性标志物、并将疾病相关基因映射至不同的视网膜细胞类型，大幅推进了视网膜研究。在人类和小鼠视网膜中，scRNA-seq进一步解析了细胞多样性，包括特化的双极神经元亚型，并为评估用于遗传性视网膜疾病研究的视网膜类器官及其他体外模型提供了重要基准。近期综述进一步强调了scRNA-seq在视网膜类器官研究中的重要性，它能够实现视网膜细胞群体的鉴定、发育轨迹的重建以及疾病相关分子特征的表征，从而为遗传性视网膜疾病建模和药物开发提供了宝贵平台。重要的是，scRNA-seq还能够对视网膜中细胞类型特异的转录变化进行高分辨率表征，并提供机会来识别在组织整体分析中可能被掩盖的分子反应。然而，尽管取得了这些进展，XLRS进展过程中RS1致病性突变的细胞类型特异性转录后果仍未被完全理解。尽管RS1功能异常的结构后果已被广泛研究，但致病理RS1突变在单个视网膜细胞群体水平所引发的分子反应仍然表征不足。值得注意的是，在疾病进展过程中，RS1突变诱导的视网膜应激如何驱动光感受器细胞、胶质细胞及其他视网膜群体间转录重塑的机制尚未被充分阐明。scRNA-seq已成为弥补这一知识空白的宝贵工具，它能够解析单个视网膜细胞类型中疾病相关的分子改变。先前的scRNA-seq研究已鉴定出在明显退化之前发生的早期光感受器应激反应，包括未折叠蛋白反应（UPR）的激活、线粒体功能障碍以及参与光转导相关基因的失调。在本研究中，我们利用患者特异性 *Rs1*^emR209C 基因敲入小鼠模型进行了scRNA-seq分析，以在单细胞分辨率水平描绘X-连锁视网膜劈裂症（XLRS）的视网膜转录组景观。本研究所使用的 *Rs1*^emR209C 基因敲入小鼠模型此前已在我们近期发表的文章中得到构建和表型表征。在该先前的研究中，通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，将患者特异性RS1 p.R209C突变引入小鼠内源性Rs1基因座。通过光学相干断层扫描成像和视网膜电图（ERG）分析确认了典型的XLRS样表型，展现了视网膜劈裂样视网膜结构异常以及异常的视网膜电生理反应。基于这一经验证的XLRS模型，本研究旨在进一步阐明疾病进展全过程中的细胞类型特异性转录重塑和分子失调。通过这种方法，我们鉴定出二肽基肽酶样蛋白10（DPP10）存在显著失调，尤其是在光感受器细胞中。DPP10作为Kv4电压门控钾通道的辅助亚基，已被发现在各种炎症相关病理状态中发挥作用。已在阿司匹林加重型呼吸系统疾病、慢性鼻窦炎、哮喘相关气道高反应性及结直肠癌进展中记录了DPP10表达升高或循环血清水平增加，其中DPP10失调与炎症活动、疾病易感性及临床预后相关。然而，DPP10在XLRS或RS1突变相关视网膜退化中的作用此前尚未被报道。因此，我们进一步在转录组、蛋白质组、组织特异性及循环血清水平上验证了DPP10的表达。这些发现表明，DPP10构成与RS1突变相关的疾病关联分子改变，可能具有作为XLRS进展生物标志物的潜力。然而，DPP10在XLRS发病机制或RS1突变相关视网膜退化中的确切作用仍有待阐明。**章节摘要****动物伦理声明**所有动物实验均经台北荣总医院机构动物照顾及使用委员会（IACUC）批准（批准号：2021-204），并遵循《实验动物饲养和使用指南》（美国国家研究委员会）。在研究期间，动物受到定期监测。在指定的实验终点，小鼠通过二氧化碳吸入后颈髓脱位处死，随后进行组织采集。**野生型对照**雄性C57BL/6J小鼠**通过CRISPR/Cas9介导构建和验证X-连锁视网膜劈裂症 *Rs1*^emR209C 基因敲入小鼠模型**为了探究患者关联RS1 R209C变异在X-连锁青少年视网膜劈裂症（XLRS）中的病理生理影响，我们利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在C57BL/6背景下构建了一种遗传学明确定义的 *Rs1*^emR209C 基因敲入小鼠模型。设计了一种向导RNA以引导Cas9在目标突变位点附近进行切割，并使用供体寡核苷酸将R209C点突变引入小鼠内源性Rs1基因座。基因组编辑**讨论**X-连锁青少年视网膜劈裂症（XLRS）传统上被认为是由视网膜分裂蛋白介导的细胞黏附和突触组织缺陷所引起的视网膜结构性疾病。在本研究中，通过整合患者特异性 *Rs1* R209C基因敲入小鼠模型与单细胞转录组分析，我们的数据显示突变视网膜中的视杆光感受器细胞存在显著的转录失调。此外，时间分析**CRediT作者贡献声明****王嘉浩（Chia-Hao Wang）：** 撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、项目管理。**蔡德崇（Der-Chong Tsai）：** 资源、项目管理。**欧阳欢（Huan Ou-Yang）：** 调查研究、形式化分析。**李纯源（Chun-Yuan Lee）：** 形式化分析、调查研究。**郑汉平（Han Ping Cheng）：** 验证、调查研究、形式化分析、概念构思。**邱世华（Shih Hwa Chiou）：** 撰写——审阅与编辑、指导监督、经费获取、概念构思。**景洛基（Lo-Jei Ching）：** 可视化、软件、资源、项目管理**伦理声明**所有参与者或其法定代理人均已签署书面知情同意书，同意参与本研究并发表相关论文。已尊重参与者的隐私权。本研究包含器官或组织捐赠。本研究包含人类生物材料，捐赠者或其近亲或法定代理人已同意将这些样本用于本研究及发表相关论文。本研究使用的样本并非来源于执行……**出版同意**所有作者同意本手稿的内容。**伦理要求合规性**本研究经机构审查委员会批准（批准号：2016-03-010A）。所有动物实验均经动物研究机构机构动物照顾及使用委员会批准（批准号：2021-204）。**利益冲突声明**作者声明不存在可能被认为影响本文所报告工作的利益冲突。**利益冲突声明**? 作者声明不存在可能被认为影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。**致谢**感谢阳明交通大学计算机系李宗义教授及台北荣总医院医学研究部蔡秉兴博士提供的技术支持。感谢蔡明隆、曾裕兴和苏宝珠进行的动物表型研究。本研究获得科技部（114-2320-B-075-010、114-2314-B-075-032）的资助。**作者：** 郑汉平 | 景洛基 | 王嘉浩 | Muhammad Reza Putra Mahardhika | 欧阳欢 | 李纯源 | 张裕立 | 蔡德崇 | 徐智坚 | 黄德匡 | 邱世华 | 陈士坚 | 林台吉 | 杨宜平