《Experimental and Molecular Pathology》：Partitioning of platelet-derived mitochondrial DNA between microparticle (MP)-associated and MP/platelet-depleted fractions during apheresis platelet storage: Predominance of a conserved MP-associated fraction
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摘要专业翻译
在单采血小板储存过程中，线粒体膜电位（MMP）逐渐下降。MMP的丧失与氧化应激和磷脂酰丝氨酸（PS）暴露相关。储存期间，微粒（MP）/血小板去除的上清液中线粒体DNA（mtDNA）水平升高。MP相关的mtDNA水平比相应上清液中检测到的mtDNA
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在单采血小板储存过程中，线粒体膜电位（MMP）逐渐下降。MMP的丧失与氧化应激和磷脂酰丝氨酸（PS）暴露相关。储存期间，微粒（MP）/血小板去除的上清液中线粒体DNA（mtDNA）水平升高。MP相关的mtDNA水平比相应上清液中检测到的mtDNA高出13倍。上清液中的mtDNA与PS暴露、氧化应激和MMP丧失相关。与羰基氰化物3-氯苯腙（CCCP）相比，ABT-737诱导产生了更高水平的上清液mtDNA。
论文解读文章
1. 研究背景与科学问题
治疗性血小板输注是管理急性出血性疾病的有效手段，然而，血小板制品的短期保存期因细菌污染风险和储存损伤而受到限制。血小板储存损伤（PSL）包括不良的表型和功能变化，表现为促聚集功能、促炎表型、促凝血功能以及促凋亡表型，这些变化伴随着大量可溶性分子的释放，包括损伤相关分子模式（DAMPs）、趋化因子、脱落物质和微粒（MPs）。血小板线粒体在晚期PSL中发挥关键作用，参与坏死和凋亡通路。已有证据表明，血小板储存伴随线粒体膜电位（MMP）降低，进而导致氧化磷酸化（OXPHOS）紊乱、活性氧（ROS）产生增加，加剧氧化应激。进行性的线粒体损伤导致线粒体膜通透性增加，促使线粒体内容物如钙离子、细胞色素C和线粒体DNA（mtDNA）释放至胞浆。
胞外mtDNA可通过多种途径产生，包括MP的脱落、完整线粒体的释放以及游离mtDNA的直接释放。不同物理状态的胞外mtDNA（如与蛋白结合或被膜包裹）对受体的可及性和炎症活性影响不同。膜包裹形式的mtDNA（如MP相关mtDNA）可能因其囊泡内容和清除机制的不同而具有独特的动力学和生物学效应。已有研究发现健康个体血液中存在高水平mtDNA却无系统性炎症，提示mtDNA主要被包裹于细胞外囊泡和线粒体内。因此，受体可及性是决定胞外mtDNA潜在生物活性的重要因素。
此前多项研究探讨了血小板制品储存期间mtDNA的释放及其在输血后不良反应中的作用，但多数研究关注的是mtDNA在整体胞外空间的变化，未系统区分MP相关与MP/血小板去除组分中mtDNA的差异分配及其与线粒体和血小板损伤的关系。基于此，本研究旨在比较单采血小板储存过程中，从MP富集组分和相应的MP/血小板去除上清液中检测到的血小板源性mtDNA，并探究它们与储存期间线粒体和血小板损伤的相关性。
2. 研究设计与技术方法
研究人员收集了6份来自健康志愿者的单采血小板浓缩物（AP-PCs），使用Haemonetics MCS+ 9000设备采集，经白细胞去除后在20–24°C持续轻柔振荡条件下储存7天，并在第1、3、5、7天取样分析。通过差速离心法将血小板贫乏血浆分为MP富集组分（16,000 ×g沉淀）和MP/血小板去除组分（16,000 ×g上清液）。采用流式细胞术检测P-选择素（CD62P）表达、磷脂酰丝氨酸（PS）暴露（Annexin V结合）、ROS生成（H?DCFDA探针）、MP计数（CD41阳性颗粒）以及MMP（JC-1染料红/绿荧光比值）。mtDNA定量采用针对NADH脱氢酶亚基6（ND6）区域的实时荧光定量PCR（qPCR），并建立标准曲线计算拷贝数。统计学分析采用Friedman检验和Dunn多重比较检验评估储存时间点差异，重复测量相关性（rmcorr）分析用于评估同一血小板单位内各变量间的关联。
3. 主要研究结果
3.1 储存依赖性P-选择素表达和磷脂酰丝氨酸暴露的增加
流式细胞术结果显示，P-选择素表达从储存第5天开始显著增加，同时PS暴露也自第5天起明显上升，表明血小板呈现促炎和促凝血表型。
3.2 储存依赖性血小板内活性氧的增加及pH变化
H?DCFDA探针检测显示，血小板内ROS水平在第5天起显著升高，伴随pH值呈下降趋势但未达统计学显著性。
3.3 储存期间血小板微粒形成增加与血小板计数变化
MP计数从第5天起显著增加，而血小板计数在整个储存期间呈下降趋势。
3.4 血小板储存期间线粒体膜电位逐渐丧失
JC-1染色结果显示，储存第7天血小板MMP显著低于第1天。作为药理学对照，ABT-737（BH3模拟物，激活内源性凋亡通路）和CCCP（线粒体解偶联剂）均诱导MMP丧失，其中CCCP诱导的丧失更为显著。
3.5 ABT-737处理产生比CCCP更高的MP/血小板去除上清液mtDNA水平
与对照组和CCCP处理组相比，ABT-737处理的第1天血小板其MP/血小板去除上清液中mtDNA水平最高，提示凋亡通路扰动与上清液mtDNA检测之间存在关联。
3.6 血小板储存期间MP/血小板去除上清液中mtDNA逐渐增加
qPCR定量显示，MP/血小板去除上清液中mtDNA水平随储存时间逐渐升高，在第7天达到峰值。
3.7 储存第7天MP相关mtDNA水平显著高于对应上清液
比较发现，储存第7天的MP富集组分中mtDNA水平比相应MP/血小板去除上清液高出约13倍，表明大部分胞外mtDNA以MP相关形式存在。
3.8 MMP与氧化应激和PS暴露呈负相关
重复测量相关性分析显示，MMP（JC-1红/绿比值）与ROS水平呈强负相关，与PS暴露也呈强负相关，提示MMP丧失伴随氧化应激增强和PS暴露增加。
3.9 MP/血小板去除上清液中mtDNA与血小板活化标志物、氧化应激和MMP丧失相关
上清液mtDNA水平与P-选择素表达、PS暴露和ROS水平呈显著正相关，而与MMP呈显著负相关，表明上清液mtDNA的增加与血小板活化、PS暴露、氧化应激和线粒体膜电位丧失密切相关。
4. 讨论与结论
本研究表明，在单采血小板储存过程中，线粒体膜电位逐渐丧失，并与氧化应激增强和磷脂酰丝氨酸暴露增加相关联。胞外mtDNA主要以MP相关形式存在，其在MP富集组分中的水平比MP/血小板去除上清液高出约13倍。尽管MP相关mtDNA占主导地位，但MP/血小板去除上清液中检测到的mtDNA仍与储存相关的血小板活化、PS暴露、氧化应激和MMP丧失呈显著相关性。值得注意的是，与坏死性刺激CCCP相比，凋亡诱导剂ABT-737可诱导更高水平的上清液mtDNA释放，提示凋亡通路可能在mtDNA向非MP包裹形式的释放中发挥作用。这些发现强调了区分mtDNA物理状态的重要性，因为MP包裹的mtDNA可能因受体不可及而不易引发炎症反应，而非MP包裹的游离mtDNA则可能更易于被免疫受体识别并介导DAMP活性。因此，未来研究应进一步阐明不同物理状态下胞外mtDNA在输血不良反应中的具体生物学功能。
