《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Combined exposure to MPs and DEHP exacerbated behavioral and cognitive impairments by inducing neuronal apoptotic damage through inhibiting the KLF2/IRF4/SRF pathway
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微塑料（microplastics, MPs）被定义为小于5 mm的塑料颗粒、碎片或纤维，是一种新型持久性环境污染物。纳米塑料（直径小于100 nm的塑料颗粒）也属于微塑料范畴，并受到广泛关注。由于塑料制品的广泛使用，人类不可避免地通过多种途径接触微塑料，其中
微塑料（microplastics, MPs）被定义为小于5 mm的塑料颗粒、碎片或纤维，是一种新型持久性环境污染物。纳米塑料（直径小于100 nm的塑料颗粒）也属于微塑料范畴，并受到广泛关注。由于塑料制品的广泛使用，人类不可避免地通过多种途径接触微塑料，其中饮食摄入是主要途径。值得注意的是，纳米塑料可通过吸附介导的转运穿越血脑屏障。大脑中的微塑料负荷显著高于其他组织，滞留颗粒主要为100–200 nm大小，浓度可达其他组织的7至30倍。累积证据表明，微塑料暴露可诱发神经毒性效应，但其神经危害及相关风险评估仍有待系统阐明。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP）是塑料制品中使用最广泛的增塑剂，易从材料中浸出并与微塑料共存于环境中。青少年经常使用塑料容器盛装热食和高脂外卖，这会加速DEHP迁移并伴随微塑料脱落，导致联合共暴露。作为一种内分泌干扰化学物，DEHP通过引发氧化应激和炎症发挥多器官毒性。发育中的中枢神经系统对DEHP尤为敏感；DEHP暴露会破坏海马突触可塑性，诱导神经元凋亡并损害学习记忆能力。现有研究大多依赖单一污染暴露模型，未能真实反映自然环境中多种污染物复杂共存的实际情况。目前，关于微塑料与DEHP联合暴露的协同神经毒性机制研究仍相对薄弱，调控联合神经损伤的关键分子通路尚未明确，存在显著研究空白。这种组合可通过同时暴露放大健康风险，因为微塑料可能作为载体增强DEHP的生物累积和毒性效应。血脑屏障作为大脑的保护屏障，在隔离外源性有害物质方面发挥关键作用。微塑料能够穿透血脑屏障，造成神经毒性损伤。大量研究表明，DEHP能够损害大脑，导致学习和记忆障碍以及焦虑样行为。单独暴露于DEHP或微塑料均可导致脑损伤，引起认知缺陷和焦虑样症状。当两者共存时，其不良效应是否会进一步加剧尚待阐明。Krüppel样因子2（Krüppel-like factor 2, KLF2）是KLF家族中关键的锌指转录因子，在神经系统中发挥重要的保护功能，广泛表达于包括海马神经元和脑血管内皮细胞在内的多种神经相关细胞类型。通过调控下游靶基因表达，KLF2在维持血脑屏障完整性、抑制神经炎症、缓解氧化应激和预防神经元凋亡中发挥多重作用。作为KLF2下游的关键转录调控分子，干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4, IRF4）的表达受KLF2直接调控，二者共同构成维持神经元生理功能和促进损伤修复的重要调控轴。已有研究表明，KLF2通过与IRF4启动子区域的特定结合位点直接相互作用，增强IRF4表达的转录激活和上调。血清反应因子（serum response factor, SRF）是中枢神经系统的基础转录因子，调控神经元存活、轴突再生、突触可塑性和细胞骨架稳态。研究表明，在缺血性脑损伤和神经毒性损伤等病理条件下，IRF4特异性结合SRF基因的启动子区域，通过转录正向激活SRF表达，从而启动下游抗凋亡和促神经元存活的基因程序。当前研究表明，环境污染物暴露可通过破坏转录调控网络导致神经损伤。然而，尚不确定微塑料与DEHP同时暴露是否通过协同抑制KLF2/IRF4/SRF通路诱导海马神经元凋亡。因此，研究KLF2在微塑料与DEHP联合暴露神经毒性中的作用至关重要。
研究背景、存在问题与研究目的
微塑料（MPs）是指粒径小于5 mm的塑料颗粒、碎片或纤维，属于新型持久性环境污染物。纳米塑料（粒径小于100 nm）也归属于微塑料范畴。人类主要通过饮食摄入、吸入和皮肤接触等途径暴露于微塑料，其中饮食摄入是主要方式。纳米塑料可通过吸附介导的转运穿越血脑屏障，且大脑中微塑料负荷显著高于其他组织，滞留颗粒主要为100–200 nm，浓度可达其他组织的7至30倍。累积证据表明微塑料暴露可诱发神经毒性，但其神经危害及风险评估尚不系统。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是塑料制品中使用最广泛的增塑剂，易从材料中浸出并与微塑料共存于环境中。青少年常使用塑料容器盛装热食和高脂外卖，加速DEHP迁移并伴随微塑料脱落，导致联合共暴露。DEHP作为内分泌干扰化学物，通过触发氧化应激和炎症发挥多器官毒性，尤其对发育中的中枢神经系统敏感，可破坏海马突触可塑性、诱导神经元凋亡并损害学习记忆。现有研究多采用单一污染暴露模型，无法真实反映自然环境中多种污染物复杂共存的现实情况。目前关于微塑料与DEHP联合暴露的协同神经毒性机制研究薄弱，关键分子通路尚未明确。因此，本研究旨在探究微塑料与DEHP联合暴露是否通过协同抑制KLF2/IRF4/SRF通路诱导海马神经元凋亡，进而加剧行为与认知障碍。
研究方法概述
研究人员采用5周龄雄性ICR小鼠（购自北京华阜康生物科技有限公司）进行体内实验，随机分为对照组（1%吐温-80）、MPs暴露组（50 mg/kg·d，200 μm MPs，购自江苏智川科技有限公司）、DEHP暴露组（200 mg/kg·d DEHP，购自Sigma-Aldrich）及联合暴露组（DP），连续灌胃8周。通过Y迷宫实验评估空间识别记忆，旷场实验评估焦虑样行为，新颖物体识别实验评估学习记忆能力。采用透射电镜观察海马超微结构，苏木精-伊红染色和尼氏染色观察海马组织病理学变化。Western blot检测成熟神经元标志物NeuN、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3）及KLF2/IRF4/SRF通路蛋白表达。体外实验选用HT22小鼠海马神经元细胞系，CCK-8法确定MPs（80 μg/ml）和DEHP（80 μmol/ml）暴露剂量，采用独立作用模型评估联合效应类型。应用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK验证凋亡在神经元损伤中的作用。通过KLF2质粒转染实现KLF2过表达，验证其对下游通路及凋亡的调控作用。
研究结果
3.1 MPs与DEHP联合暴露导致小鼠行为认知障碍并引起海马神经元凋亡损伤
Y迷宫实验显示，与对照组相比，MPs组和DEHP组自发交替率下降，联合暴露组下降更明显，表明联合暴露损害学习记忆功能。旷场实验表明，MPs组和DEHP组中央活动时间减少、中点距离增加，联合暴露组小鼠几乎不在中央活动，中点距离显著增加，提示联合暴露加剧焦虑水平。新颖物体识别实验发现，MPs和DEHP单独暴露组对新物体的识别效率降低，联合暴露组识别效率显著低于其他组，表明联合暴露减弱探索行为。HE染色显示，MPs或DEHP暴露导致正常神经元数量显著减少，联合暴露加剧这一效应；联合暴露组神经元出现明显的核收缩、水肿增加、排列紊乱和凋亡小体增多。尼氏染色表明，MPs或DEHP暴露导致尼氏体数量减少，联合暴露组尼氏体数量低于单独暴露组。突触超微结构定量分析显示，与对照组相比，单独暴露组突触间隙宽度增加、突触后致密带厚度减小、活性区长度缩短，这些改变在联合暴露组更为显著。
3.2 MPs与DEHP联合暴露通过抑制KLF2/IRF4/SRF信号通路诱导小鼠神经元凋亡
Western blot结果显示，MPs和DEHP暴露导致神经元特异性核蛋白NeuN表达降低，联合暴露组下降更显著，证实联合暴露加重神经元损伤。与对照组相比，单独暴露组促凋亡蛋白Bax表达升高，联合暴露组进一步上调；抗凋亡蛋白Bcl-2在单独暴露组降低，联合暴露组下降更显著；cleaved caspase-3在单独暴露组表达上调，联合暴露组增加更明显。KLF2/IRF4/SRF信号通路蛋白在MPs和DEHP暴露后均下降，联合暴露组进一步降低，表明联合暴露抑制该通路导致神经元凋亡损伤。
3.3 MPs与DEHP联合暴露通过抑制KLF2/IRF4/SRF信号通路引起HT22细胞凋亡损伤
CCK-8法确定MPs剂量为80 μg/ml、DEHP剂量为80 μmol/ml。基于独立作用模型计算，细胞活性EC值为38.74%，小于实际测量的EC组合值51.49%，表明联合暴露对细胞活性的影响为协同效应。WB检测显示，MPs和DEHP组NeuN表达受抑制，联合暴露组NeuN水平下降更显著。促凋亡蛋白Bax和caspase-3在MPs和DEHP组均升高，抗凋亡蛋白Bcl-2降低，KLF2/IRF4/SRF通路蛋白也呈现降低趋势，这些趋势在联合暴露组更为明显，表明联合暴露加剧神经元凋亡损伤。
3.4 凋亡抑制剂Z-VAD-FMK减轻HT22细胞损伤
使用泛caspase不可逆抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡后，Western blot显示HT22细胞中NeuN表达增加。然而，KLF2通路蛋白和凋亡相关蛋白表达未被Z-VAD-FMK处理逆转，表明DEHP和MPs引起的神经元损伤与凋亡相关，且KLF2通路位于凋亡上游。
3.5 KLF2过表达可通过增强KLF2/IRF4/SRF信号通路减轻HT22细胞凋亡损伤
将KLF2质粒转染至HT22细胞实现KLF2过表达后，Western blot验证了转染效率。KLF2过表达抵消了暴露组中KLF2/IRF4/SRF的下调，证实成功转染并激活该信号通路。此外，KLF2过表达减轻了MPs和DEHP的有害效应，表现为NeuN表达增加及凋亡相关蛋白的改变，表明KLF2对MPs和DEHP诱导的神经元损伤发挥保护作用，且神经元凋亡损伤是由KLF2/IRF4/SRF通路表达降低所致。
讨论与结论
讨论部分指出，微塑料可直接穿越血脑屏障，破坏紧密连接蛋白并损害屏障通透性，在神经元内扰乱细胞内通路，引发DNA损伤、内质网应激和线粒体损伤，同时加剧氧化应激并抑制活性氧清除能力，最终导致神经毒性。DEHP同样通过氧化应激、线粒体损伤、神经炎症和神经元凋亡等机制诱导神经元损伤。现有研究表明，微塑料与DEHP联合暴露可通过协同相互作用加剧氧化应激和线粒体功能障碍，增加神经元损伤的可能性。本研究体内实验证明联合暴露可显著诱导海马神经元凋亡，联合暴露组的毒性效应比单独暴露组更明显；体外实验中联合暴露组细胞促凋亡蛋白Bax表达升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低、Bax/Bcl-2比值显著增加。通过独立作用模型确认微塑料与DEHP之间存在协同相互作用。研究还揭示了KLF2/IRF4/SRF通路在联合暴露诱导的神经元凋亡中的调控作用。使用Z-VAD-FMK证实凋亡介导了联合暴露引起的神经元损伤，且KLF2/IRF4/SRF通路作为上游调控因子。KLF2过表达实验进一步证实恢复KLF2可挽救被抑制的通路蛋白、减少凋亡并减轻神经元损伤。
研究结论：体内实验表明，微塑料与DEHP联合暴露诱导小鼠海马神经元凋亡并抑制KLF2/IRF4/SRF信号通路，从而加剧认知和行为障碍。体外实验利用凋亡抑制剂和质粒转染证实，联合暴露降低KLF2/IRF4/SRF信号通路表达并引起HT22海马神经元凋亡损伤。总体而言，这些发现为阐明环境相关塑料污染物的神经毒性机制提供了新的实验证据，并为针对神经损伤保护的干预措施提出了潜在靶点。
