戊唑醇通过GPX4诱导铁死亡损害人滋养层细胞功能：不明原因复发性流产的多组学研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Tebuconazole-induced ferroptosis impairs human trophoblast function via GPX4: A multi-omics study on unexplained recurrent pregnancy loss

　　

戊唑醇（tebuconazole, TEB）通过诱导谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）相关的铁死亡（ferroptosis）损害人胎盘滋养层细胞功能。TEB在人胎盘滋养层细胞中诱导GPX4相关的铁死亡；TEB损害滋养层细胞的增殖、迁移和雌二醇（estradiol, E2）分泌；不明原因复发性流产（recurrent pregnancy loss, RPL）病例的绒毛组织含有高于正常妊娠对照的TEB水平；整合多组学与网络毒理学分析将TEB暴露与铁死亡及滋养层功能障碍联系起来。

研究背景与问题

环境农药暴露已被确认为人类健康的威胁，并与复发性流产（recurrent pregnancy loss, RPL）、胎儿生长受限（fetal growth restriction, FGR）、发育异常和不孕不育密切相关。三唑类杀菌剂是全球用量最大的农药类别之一，戊唑醇（tebuconazole, TEB）是其中应用最广的品种，在土壤和作物中半衰期长，可通过食物链在水、土壤和生物体内蓄积。人群生物监测已在尿液、血液和脂肪组织中检出TEB及其主要代谢物羟基戊唑醇（hydroxy-tebuconazole, TEB-OH），证明人类存在系统性暴露。TEB可以穿过胎盘屏障，干扰甾体合成酶如芳香化酶（CYP19A1），并引起氧化应激；而氧化应激与铁依赖性细胞死亡程序——铁死亡（ferroptosis）直接相关。铁死亡的核心防御酶是谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4），铁过载可通过Fenton反应催化脂质过氧化。然而，TEB暴露是否在人胎盘激活这一通路此前尚不清楚。

RPL定义为连续两次或以上妊娠丢失，影响1%–5%的夫妇，其中相当一部分病因不明。滋养层细胞是胎盘的核心功能单元，其增殖、迁移、侵袭和激素合成对胚胎着床和胎儿发育至关重要，滋养层功能障碍是RPL和FGR的标志性改变。已有动物研究报道TEB可诱导铁死亡和FGR，但缺乏人体证据。为此，研究人员提出三个关键问题：不明原因RPL的绒毛组织是否携带更高的TEB/TEB-OH负荷；亚细胞毒性浓度的TEB是否损害人滋养层细胞活力、内分泌功能和运动能力；GPX4是否介导TEB触发铁死亡的分子靶点。

研究人员首先利用高效液相色谱-串联质谱法（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS）量化不明原因RPL与正常妊娠妇女绒毛组织中的TEB/TEB-OH；随后在BeWo和HTR-8/SVneo人滋养层细胞系中观察TEB对活力、雌二醇（estradiol, E2）分泌、迁移和铁稳态的影响；结合RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、Western blot、网络毒理学和分子对接，并通过铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）和GPX4抑制剂RSL-3进行拯救实验。研究得出结论：TEB通过GPX4相关的铁死亡改变损害滋养层功能，绒毛组织TEB负荷与RPL存在临床关联，GPX4是候选分子靶点。该研究首次将人类实际暴露、细胞功能障碍和候选分子靶点联系起来，为环境TEB暴露与RPL风险提供了机制证据，也为生殖健康风险评估和预防策略提供了依据。

主要技术方法

临床绒毛组织样本来自正常妊娠和不明原因RPL孕妇（经温州医科大学附属第二医院伦理委员会批准，批准号2024-K-040-01），采用HPLC-MS/MS定量TEB及TEB-OH；在BeWo和HTR-8/SVneo细胞中进行CCK-8活力检测、E2 ELISA、划痕迁移实验和亚铁离子（Fe²⁺）比色测定；对HTR-8/SVneo细胞进行RNA-seq转录组测序，并用qRT-PCR和Western blot验证；使用Fer-1和RSL-3进行铁死亡拯救实验；通过网络毒理学和分子对接预测TEB靶点及结合模式。

研究结果

3.1 临床分析显示TEB暴露与复发性流产相关

通过HPLC-MS/MS检测正常妊娠与不明原因RPL绒毛组织，发现RPL组TEB浓度显著高于对照组，提示内暴露TEB与不良妊娠结局存在临床流行病学关联；TEB-OH差异未达统计学显著，但RPL组呈升高趋势。

3.2 TEB在高浓度下诱导BeWo和HTR-8滋养层细胞毒性

CCK-8结果显示，160和320 μM TEB在24、48和72 h均显著抑制BeWo和HTR-8细胞活力，且呈剂量和时间依赖性。基于此，研究人员选择无显著细胞毒性浓度的0、20、40、80 μM TEB进行后续功能机制研究。

3.3 TEB降低滋养层细胞E2水平、损害迁移并扰乱铁稳态

ELISA结果显示，TEB显著降低BeWo和HTR-8细胞培养上清中的E2水平；划痕实验显示40 μM及以上浓度TEB暴露48 h显著抑制HTR-8细胞迁移；ferrozine比色法显示TEB处理组细胞内Fe²⁺水平显著升高。上述结果表明TEB损害滋养层内分泌功能、迁移能力和铁稳态。

3.4 TEB诱导HTR-8滋养层细胞转录组改变

RNA-seq结果显示，20、40、80 μM TEB处理后分别有237/193、241/250、797/883个上/下调差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析显示，TEB以浓度依赖性方式扰动免疫炎症反应、甾体激素分泌、细胞迁移、内质网应激和氨基酸合成等生物学过程。

3.5 通过RT-qPCR验证转录组结果

对包括CYP1A1、AQP1、SLC40A1、EIF2AK2、TFRC、GPX4在内的基因进行qRT-PCR验证，结果显示其表达变化方向与相对幅度与RNA-seq高度一致。

3.6 TEB扰动HTR-8滋养层细胞蛋白表达谱

Western blot显示，TEB在20 μM即显著下调TFRC和GPX4蛋白，40 μM下调EIF2AK2，80 μM下调SLC40A1；同时CYP1A1和AQP1蛋白显著上调。蛋白水平变化与mRNA水平趋势一致，证实TEB干扰铁代谢、抗氧化防御、外源物代谢和应激反应通路。

3.7 TEB失调控制细胞命运和功能的核心信号通路

整合转录组和生化数据发现，TEB下调铁稳态基因（TFRC、SLC40A1）和铁死亡防御基因GPX4，与细胞内Fe²⁺蓄积一致；同时上调内质网应激和凋亡相关基因，改变TNF和MAPK相关炎症信号，并抑制肌动蛋白细胞骨架和黏着斑基因表达，为迁移抑制提供分子基础。

3.8 TEB诱导HTR-8/SVneo滋养层细胞铁死亡相关改变并抑制迁移和内分泌功能

TEB和RSL-3处理均显著抑制HTR-8/SVneo细胞迁移、降低E2水平、增加细胞内Fe²⁺、丙二醛（malondialdehyde, MDA）和脂质活性氧（lipid reactive oxygen species, lipid ROS）；Fer-1共处理可部分逆转这些改变。Western blot显示TEB下调GPX4、SLC40A1和TFRC，Fer-1可减轻这些铁死亡标志物的变化。结果表明铁死亡相关脂质过氧化参与TEB诱导的滋养层功能障碍。

3.9 网络毒理学验证TEB参与妊娠并发症相关通路

网络毒理学分析显示TEB相关靶点与RPL和FGR基因集分别有78和117个重叠，核心交集共72个基因。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析显示“甾体激素生物合成”“卵巢甾体生成”“PI3K-Akt信号通路”“MAPK信号通路”“p53信号通路”“TNF信号通路”“细胞色素P450对外源物的代谢”等通路显著富集；GO分析富集到“对外源物刺激的反应”“对有毒物质的反应”“甾体代谢过程”“凋亡信号通路调控”等条目。转录组数据与网络毒理学结果共有17条高度一致的信号通路。

3.10 分子对接将GPX4鉴定为TEB的候选结合靶点

分子对接预测TEB与GPX4的结合抑制常数（K_i）为44.74 μM，恰好位于20–80 μM有效浓度范围内；与AQP1、TFRC、SLC40A1、EIF2AK2和CYP1A1的预测结合力显著较弱。该结果将GPX4列为TEB在检测靶点中的候选结合靶点。

讨论与结论

讨论部分指出，该研究首次提供了人类绒毛组织内TEB暴露与RPL相关的直接证据，并将铁死亡鉴定为滋养层损伤的新机制。TEB下调GPX4、TFRC和SLC40A1，同时伴随Fe²⁺蓄积，这一特征比一般氧化应激更特异。CYP1A1诱导与E2下降的关联提示外源物代谢可能与甾体合成竞争底物或辅因子，但该假说尚未直接验证。Fer-1拯救实验支持脂质过氧化对TEB毒性的贡献，但GPX4直接结合和酶活性抑制仍未证实。研究局限性包括病例对照设计不能确立因果、滋养层细胞系无法完全模拟胎盘结构、所用浓度高于环境水相浓度以及未评估长期低剂量暴露效应。未来需在前瞻性队列、原代滋养层/胎盘类器官模型中验证，并开展长期低剂量暴露和代谢组学研究。

本研究提供了强有力的临床和机制证据，表明杀菌剂TEB是一种具有促进RPL潜力的生殖毒物。研究人员在胎盘滋养层细胞中鉴定出铁死亡相关改变、铁稳态失调、迁移受损和E2水平降低；GPX4仍是候选结合靶点而非经确认的直接靶点；ferrostatin-1对铁死亡的药理学阻断可减轻TEB引发的脂质过氧化、铁积累和功能缺陷。网络毒理学的整合将这些细胞病理学锚定于RPL和FGR已知的分子图谱。这些发现揭示了TEB对胎盘健康的威胁，支持在风险评估中对其加强关注，并推动对妊娠疾病中铁死亡相关过程的进一步研究。