聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）经溶酶体酸化障碍介导ACSL4过积累并触发铁死亡依赖性肝损伤

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Polystyrene nanoplastics trigger ferroptosis-dependent liver injury caused by ACSL4 overaccumulation

　　

聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs；polystyrene nanoplastics）通过触发铁死亡（ferroptosis）诱导肝损伤。溶酶体功能障碍（lysosomal dysfunction）参与PS-NPs诱导的铁死亡。PS-NPs通过改变溶酶体酸化（lysosomal acidification）影响溶酶体功能。

微/纳米塑料（MNPs；micro- and nanoplastics）是持久性环境污染物，包括最长尺寸小于5 mm的微塑料（MPs；microplastics）和小于100 nm的纳米塑料（NPs；nanoplastics）。MNPs污染已被视为与海洋酸化、臭氧消耗和气候变化并列的重大环境挑战。肝脏是外源物代谢和解毒的主要器官，也是MNPs暴露后塑料颗粒蓄积的重要部位。MNPs已在人肝组织中检出，体内实验、体外细胞实验、类器官模型和人组织研究提示，MNPs暴露可致肝功能相关生化指标异常、能量和脂质代谢紊乱、氧化应激，并与肝脂肪变性、肝纤维化甚至肝细胞癌发生相关。系统综述将氧化应激、炎症、脂质代谢功能障碍和肝细胞凋亡列为MNPs诱导肝损伤的主要特征。聚苯乙烯（PS；polystyrene）是全球产量和使用最广的塑料之一，也是研究MNPs生物蓄积和毒理效应的常用模型材料。既往机制研究显示，MNPs可经内吞进入细胞并蓄积于溶酶体，损害其正常功能；在肝脏中，溶酶体损伤可能是MNPs诱导炎症反应的早期事件。铁死亡（ferroptosis；铁依赖性脂质过氧化驱动的调节性细胞死亡）在形态和机制上不同于凋亡、坏死和自噬，近期证据提示溶酶体损伤与铁死亡激活关系密切。然而，MNPs诱导肝损伤的机制仍不完全清楚，尤其是铁死亡在其中的贡献。为此，研究人员使用PS-NPs研究铁死亡在NPs诱导肝损伤中的作用，以期加深对NPs肝毒性机制的理解并寻找潜在治疗靶点。

关键技术方法：动物实验采用5周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自Army Medical University（Chongqing，China），随机分为对照、Fer-1、PS-NPs、PS-NPs+Fer-1四组，PS-NPs经饮食80 mg/kg饲料暴露16周，Fer-1腹腔注射1 mg/kg、每周2次。细胞采用小鼠肝细胞AML12，购自Noblebio（浙江，中国），以0、50、100、150 μg/mL PS-NPs处理72 h。方法包括透射电子显微镜（TEM；transmission electron microscopy）与Zeta电位表征、苏木精-伊红（H&E）染色及Suzuki评分、MTT/LDH检测、AST/ALT检测、Fe²⁺检测、GSH/GSSG检测、ROS检测、蛋白质印迹、LysoTracker/免疫荧光、活细胞荧光（FerroOrange、BODIPY 581/591 C11、BBcellProbe? P02）、液相色谱-质谱（LC-MS）脂质组学、串联质谱标签（TMT；tandem mass tagging）定量蛋白质组学及统计。

3.1 PS-NPs accumulates in AML12 cells and induces cytotoxicity in vitro。研究人员用TEM和Zeta电位表征PS-NPs，颗粒呈球形、平均80±8 nm、弱负电；荧光标记PS-NPs处理AML12细胞24 h后，胞质出现强点状绿色信号，表明明显胞内蓄积。72 h后，100和150 μg/mL降低细胞活力，50、100、150 μg/mL均增加乳酸脱氢酶（LDH；lactate dehydrogenase）释放，说明PS-NPs易被AML12细胞摄取并诱导细胞毒性。

3.2 PS-NPs disrupts lipid metabolism in a manner consistent with ferroptosis。通过LC-MS脂质组学发现，PS-NPs暴露显著改变细胞脂质谱，鉴定867种脂质代谢物、47类脂质，223种非冗余差异脂质分为五大类；京都基因与基因组百科全书（KEGG；Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集包括不饱和脂肪酸生物合成和甘油磷脂代谢，磷脂酰乙醇胺（PE；phosphatidylethanolamine）18:0/20:4等PE物种突出，与铁死亡相关，提示PS-NPs诱导脂质重塑并可能关联铁死亡。

3.3 PS-NPs exposure induces ferroptosis in AML12 cells。研究人员检测Fe²⁺、活性氧（ROS；reactive oxygen species）、脂质过氧化和铁死亡相关蛋白。PS-NPs增加Fe²⁺和ROS，100/150 μg/mL增加脂质过氧化，降低谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4；glutathione peroxidase 4）和溶质载体家族7成员11（SLC7A11；solute carrier family 7 member 11），增加酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4；acyl-CoA synthetase long chain family member 4）、花生四烯酸15-脂氧合酶（ALOX15；arachidonate 15-lipoxygenase）和花生四烯酸12-脂氧合酶（ALOX12；arachidonate 12-lipoxygenase）。铁死亡抑制剂铁抑素-1（Fer-1；ferrostatin-1）降低Fe²⁺、脂质过氧化和ROS，恢复细胞活力和GPX4，但不显著降低ACSL4。结果表明PS-NPs诱导AML12细胞铁死亡。

3.4 Proteomic analysis implicates lysosomal dysfunction in PS-NPs-induced ferroptosis。TMT定量蛋白质组学显示样本组内相关性强，主成分分析（PCA；principal component analysis）无离群，层次聚类可区分组间蛋白表达；以差异倍数>1.5或<0.67且P<0.05为阈值，鉴定80个差异表达蛋白（DEPs；differentially expressed proteins），其中49个上调、31个下调，KEGG富集溶酶体、萜类骨架生物合成和马达蛋白等九条通路。结果提示溶酶体功能障碍可能参与PS-NPs诱导的铁死亡。

3.5 PS-NPs promotes ACSL4 accumulation and ferroptosis by impairing lysosomal function。研究人员检测溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1；lysosomal-associated membrane protein 1）、组织蛋白酶D（CTSD；cathepsin D）、组织蛋白酶F（CTSF；cathepsin F）、溶酶体pH和ACSL4共定位。PS-NPs降低LAMP1，100/150 μg/mL降低CTSD和CTSF，增加溶酶体pH，并增加ACSL4与溶酶体共定位。溶酶体激活剂NKH477恢复溶酶体活性后，提高细胞活力，降低溶酶体pH、ACSL4水平及ACSL4-溶酶体共定位，增加GPX4。结果表明PS-NPs损害溶酶体功能，导致ACSL4累积和铁死亡反应。

3.6 PS-NPs exposure induces ferroptosis-associated liver injury in mice。16周小鼠实验中，PS-NPs降低肝GPX4、增加ACSL4；Fer-1恢复GPX4，但不显著逆转ACSL4。PS-NPs降低肝LAMP1，Fer-1不显著逆转该降低。长期PS-NPs暴露未显著影响体重，但H&E染色显示肝充血和空泡变性，Suzuki肝损伤评分升高，Fer-1降低评分。PS-NPs增加血清Fe²⁺并降低GSH/GSSG，Fer-1恢复GSH/GSSG但不显著降低Fe²⁺。PS-NPs增加肝AST和ALT，Fer-1显著减轻二者升高。结果说明长期PS-NPs暴露诱导肝铁死亡并导致肝损伤。

讨论部分指出，研究人员结合体内外方法研究PS-NPs肝损伤机制，发现PS-NPs通过溶酶体功能障碍及随后ACSL4蓄积诱导肝细胞铁死亡。剂量选择依据土壤MNPs平均浓度500.0±266.7 mg/kg，80 mg/kg饲料为相关暴露场景；体外100 μg/mL为显著降低细胞活力的最低浓度。脂质组学显示含长链多不饱和脂肪酸（PUFAs；polyunsaturated fatty acids）的脂质改变，PE 18:0/20:4等与铁死亡强相关；ACSL4等可将游离PUFAs掺入膜磷脂，增加脂质过氧化易感性。蛋白质组学提示溶酶体功能障碍位于铁死亡上游。LAMP1有助于维持溶酶体膜稳定和酸化，CTSD、CTSF参与蛋白降解；PS-NPs降低这些蛋白并破坏酸性环境。ACSL4可经热休克同源蛋白70（HSC70；heat shock cognate 70）识别后由伴侣介导自噬递送至溶酶体降解，溶酶体功能受损可能妨碍ACSL4清除。NKH477减少ACSL4表达和溶酶体共定位。Fer-1在体内外减轻铁死亡和肝损伤。局限包括NKH477可能有不依赖溶酶体激活的作用，且研究未直接抑制或耗竭ACSL4、阻断溶酶体降解或测量ACSL4周转；ACSL4与溶酶体共定位本身不能证明其被靶向溶酶体降解，因此“溶酶体降解受损导致ACSL4蓄积继而促进铁死亡”的因果顺序尚未确认。未来需ACSL4功能缺失、选择性抑制溶酶体降解及直接测量ACSL4周转。

研究结论翻译：本研究表明，暴露于PS-NPs与肝细胞中溶酶体功能受损、ACSL4表达增加、GPX4表达降低以及与铁死亡一致的变化相关。用NKH477激活溶酶体可降低ACSL4水平、增加GPX4水平并部分恢复细胞活力。这些发现提示，溶酶体功能可能影响ACSL4与GPX4之间的平衡，从而影响铁死亡相关反应。总体而言，本研究提高了对NPs如何导致肝损伤的理解，并将溶酶体功能和ACSL4确定为降低塑料污染健康风险的潜在靶点。需要进一步研究确认其治疗潜力。