塑化剂暴露经EGFR/MYC/PTEN/mTOR介导的HPG轴激活失调诱导中枢性性早熟：网络毒理学、分子对接/分子动力学与DEHP小鼠模型证据

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Plasticizers induce central precocious puberty via dysregulation of EGFR/MYC/PTEN/mTOR-mediated HPG axis activation

　　

EGFR、MYC、PTEN和MTOR是细胞周期调控、信号传导及可溶性定位中的重要CPP（中枢性性早熟）靶点。邻苯二甲酸酯类，例如丁基苄基邻苯二甲酸酯（butyl benzyl phthalate），通过范德华力和静电作用与EGFR强结合（?8.0 kcal/mol）。该研究揭示了塑化剂与CPP之间的分子联系，为早期预防和新型治疗靶点提供依据。DEHP（邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯）通过下调下丘脑和垂体中PTEN并上调EGFR/MYC/MTOR，导致HPG轴（下丘脑-垂体-性腺轴）失调。

论文解读文章

研究背景：中枢性性早熟（central precocious puberty, CPP）是由下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamic-pituitary-gonadal axis, HPG轴）提前激活导致的疾病，可损害生长潜力和心理健康。其发生与超重和肥胖、内分泌干扰化学物（endocrine-disrupting chemicals, EDCs）、遗传易感和器质性疾病有关。中国流行病学调查显示CPP发病率逐年上升，因此理解其病理生理机制并开发针对性诊疗策略十分重要。EDCs是外源性物质，可改变器官发育、生殖和代谢等关键生物学过程，常见者包括塑化剂（如邻苯二甲酸酯、双酚A）、重金属、有机氯农药及其他环境/工业化学品。既往大量研究提示高水平邻苯二甲酸酯暴露与女性青春期提前相关，但塑化剂诱导CPP的分子机制仍不清楚。DEHP（di(2-ethylhexyl) phthalate）是最广泛使用的塑化剂，可经摄入、皮肤接触、吸入和医疗暴露进入人体，儿童暴露高于成人。因此，研究人员建立并验证DEHP诱导的小鼠CPP模型，结合网络毒理学、分子对接和分子动力学模拟，探索CPP中HPG轴过度激活的潜在分子机制。

技术方法：研究人员采用网络毒理学与分子模拟结合动物实验。疾病靶点来自GeneCards、OMIM、MalaCard，塑化剂活性成分靶点来自SwissTargetPrediction、PharmMapper、CTD；STRING构建PPI，Cytoscape/CytoHubba筛选，GeneMANIA、HitPredict、ENSEMBL、DeepLoc-2.1分析功能和定位；DIANA-microT、TargetScan、starbase、miRNet构建ceRNA/TF网络；clusterProfiler做GO/KEGG；CB-Dock2分子对接，100 ns MD与MM-PBSA评价。动物为Chengdu Yaokang Biotechnology Co., Ltd.提供的12只雌性C57BL/6J小鼠，3周龄，随机分为对照组和250 mg/kg DEHP灌胃模型组，PND35取材；采用阴道开口、发情周期、HE、ELISA、RT-qPCR、Western blot验证。

研究结果：
3.1 鉴定54个候选靶点（Identification of 54 candidate targets）：通过三个数据库获得811个塑化剂活性成分靶点和418个CPP疾病靶点，交集获得54个候选靶点；PPI分析显示52个蛋白存在相互作用，其中TP53和INS交互较多。
3.2 鉴定EGFR、MYC、PTEN和MTOR为生物标志物（Identification of EGFR, MYC, PTEN, and MTOR as biomarkers）：利用CytoHubba多种拓扑算法分组取前20并交集，最终确定EGFR、MYC、PTEN和MTOR四个生物标志物用于后续分析。
3.3 EGFR、MYC、PTEN和MTOR功能分析（Function analysis of EGFR, MYC, PTEN, and MTOR）：GeneMANIA显示四者参与细胞周期G1/S期转变、蛋白激酶B信号调节、上皮细胞迁移等；HitPredict获得34个高置信互作蛋白。
3.4 生物标志物染色体定位、亚细胞定位及调控网络富集分析（Chromosomal location, subcellular localization and regulatory network enrichment analysis of biomarkers）：MTOR位于1号染色体，EGFR位于7号，MYC位于8号，PTEN位于10号；EGFR主要分布于细胞膜，MYC主要富集于细胞核，MTOR、MYC和PTEN均有一定比例可溶性蛋白；miRNA靶向EGFR、MTOR、MYC和PTEN数量分别为4、8、10、37，获得474个lncRNA和93个转录因子；GO富集876个BP、122个CC、53个MF，KEGG富集92条通路，前10条包括癌症中心碳代谢、乳腺癌和肝细胞癌等。
3.5 生物标志物与活性成分靶点具有高亲和力（Biomarkers and active ingredient targets with high affinity）：分子对接显示MTOR仅与DEHP相互作用，MYC和PTEN与DEHP及丁基苄基邻苯二甲酸酯相互作用，EGFR与phthalate 810、dioctyl sebacate、dibutyl phthalate和butyl benzyl phthalate相互作用。EGFR与butyl benzyl phthalate结合自由能最高为?8.0 kcal/mol，MYC与DEHP最低为?5.2 kcal/mol。MD显示EGFR-butyl benzyl phthalate和PTEN-butyl benzyl phthalate复合物稳定性较高，MYC-butyl benzyl phthalate较弱；RMSF<0.4 nm，SASA<200，Rg为1.5–3 nm；范德华和静电作用为主要稳定因素。
3.6 DEHP诱导CPP小鼠模型的建立与验证（Establishment and validation of the DEHP-induced CPP mouse model）：DEHP从PND21暴露14天，PND35检测。模型组阴道开口扩张、开放提前，平均28.33天，对照组33.67天；发情周期各阶段加速；卵巢和子宫指数增加；HE显示模型组原/初级卵泡减少，次级和闭锁卵泡增多，黄体明显增多；血清FSH、LH和E₂显著升高。因此成功建立DEHP诱导的CPP小鼠模型。
3.7 DEHP诱导CPP中EGFR、c-MYC、PTEN和mTOR验证（Validation of EGFR, c-MYC, PTEN, and mTOR in DEHP-induced CPP）：qRT-PCR显示垂体PTEN mRNA无显著差异，EGFR、mTOR和MYC显著升高；下丘脑PTEN mRNA和蛋白下调，EGFR、mTOR和c-MYC在下丘脑或垂体上调，差异显著。提示PTEN主要在下丘脑失调，EGFR、mTOR和c-MYC与DEHP诱导CPP表型相关，可能是HPG轴异常的生物标志物。
3.8 RT-qPCR验证经典青春期调节因子（Validation of canonical pubertal regulators by RT-qPCR）：模型组下丘脑Kiss1、Kiss1r、Gnrh1、Tac2、Pdyn和垂体Lhb表达显著升高，表明KNDy/kisspeptin-GnRH神经内分泌轴活动增强，支持CPP模型建立。

讨论总结：讨论认为，EGFR是跨膜受体酪氨酸激酶，介导信号转导和细胞增殖；MYC是转录因子，调控细胞周期、凋亡、糖酵解、血管生成和免疫逃逸；PTEN抑制PI3K/AKT信号；mTOR与青春期启动相关，DEHP可通过激活PI3K/Akt/mTOR促进CPP。四个生物标志物参与细胞周期、迁移和信号调节，KEGG富集到癌症通路，提示塑化剂暴露和CPP可能扰动癌症相关级联，临床上需长期随访乳腺/肝脏健康。分子对接和MD显示邻苯二甲酸酯与靶点结合具有特异性，EGFR结合谱最广，可能作为上游启动子。DEHP模型多维验证显示HPG轴提前激活，PTEN下调解除PI3K/AKT/mTOR抑制，EGFR上调放大信号，导致促性腺激素和性激素分泌过多；KNDy/kisspeptin-GnRH网络激活。该研究提供塑化剂诱导CPP的候选生物标志物和预防治疗靶点。

结论翻译：本研究通过多组学和实验验证，鉴定EGFR、MYC、PTEN和mTOR为塑化剂诱导CPP的核心靶点，阐明其在HPG轴激活和塑化剂结合机制中的作用。研究人员新鉴定EGFR和MYC为两个候选上游节点，桥接DEHP内分泌干扰与该既定通路过度激活，同时阐明PTEN在下丘脑-垂体区室中的组织特异性表达模式，这在既往相关研究中尚未报道。局限性包括缺乏药理学干预和基因拯救实验确认这些分子与DEHP诱导CPP表型之间的因果关系；体内样本量较小（每组n=6）可能放大小鼠生物学异质性、降低统计效力并增加假阳性和假阴性风险；对照和DEHP暴露小鼠在固定PND35处死终点处于不同发情周期阶段，因此循环FSH、LH和E₂差异不能完全与DEHP驱动CPP效应和发情周期相关激素波动区分；每只动物仅取一个卵巢中段切片进行卵泡计数，卵泡定量基础薄弱；调控网络中的上游miRNA、lncRNA和转录因子仅通过生物信息学预测而未实验验证；PPI网络筛选偏倚可能遗漏位于互作组外周而非核心枢纽的配体结合调控基因；缺乏足够体内/体外验证和大临床样本验证。未来研究将探索塑化剂对CPP的毒理效应，开展靶向功能拯救和机制验证实验，扩大动物样本量以增强统计可靠性，纳入雌雄小鼠组以表征DEHP的性别依赖性毒性反应，尝试更好区分发情周期相关激素变化与DEHP暴露效应，补充被忽略的经典青春期相关内分泌生物标志物的分子对接和结合验证，对基因开展深入功能实验，通过评估每只动物多个卵巢切片优化卵泡计数方案，并扩大临床样本量，将这些发现转化为CPP临床预防和治疗策略。