《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Visual biosensing of bioaccessible mercury in aquatic environments using chromoprotein-based whole-cell sensors
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基于色素蛋白的生物传感器可在无需有机溶剂萃取的情况下检测汞。双模式读取策略支持肉眼筛查与精确量化。模块化的MerB工程使得检测无机汞和甲基汞成为可能。现场可部署平台已验证其在地表水汞筛查中的适用性。
基于色素蛋白的生物传感器可在无需有机溶剂萃取的情况下检测汞。双模式读取策略支持肉眼筛查与精确量化。模块化的MerB工程使得检测无机汞和甲基汞成为可能。现场可部署平台已验证其在地表水汞筛查中的适用性。
### 论文解读文章
#### 1. 研究背景与问题
汞是一种剧毒重金属，可通过水生食物链中的生物累积和生物放大效应对生态系统和人类健康构成重大威胁。人为活动释放的无机汞（Hg(II)）是微生物甲基化生成甲基汞（MeHg）的底物，而甲基汞作为一种强效神经毒素，可通过受污染的鱼类和贝类饮食途径在顶级捕食者和人体内蓄积。考虑到汞相关健康风险的严重性，各国政府和国际机构已针对饮用水和环境基质中的汞设定了严格的监管限值。传统的定量技术如原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法和原子吸收光谱法仍是汞分析的黄金标准，具有优异的灵敏度和准确性。然而，这些仪器方法需要昂贵的设备、复杂的样品预处理和熟练的操作人员，严重限制了其在资源有限环境中进行常规现场筛查和高通量监测的部署能力。为规避这些限制，研究人员探索了电化学传感器、纳米颗粒比色法和生物传感器等替代方案。其中，基于细菌mer操纵子的全细胞生物传感器因其能够报告操作性生物可利用汞组分、通过自我复制降低检测成本，并能通过简单培养产生可检测信号而不需要复杂仪器而成为颇具前景的候选方案。然而，许多现有构型依赖荧光或生物发光报告基因，需要激发光源、商业底物或暗室检测条件，从而削弱了其现场应用的实用性。基于色素的视觉报告系统，如紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素、靛蓝和靛蓝素，已被越来越多地用于实现直接裸眼读数并减少对设备的依赖，但这些系统通常需要在比色测量前进行有机溶剂萃取，使流程复杂化并产生危险废物。色素蛋白（CPs）是一类无需外源底物、辅因子或激发光照即可吸收可见光的深色蛋白，为上述问题提供了有吸引力的替代方案。尽管已有工程研究表明真核CPs（如amilCP、aeBlue和tsPurple）可在工程细菌中功能性表达，但它们在成熟动力学、热稳定性和适应代价方面表现出显著差异。值得注意的是，aeBlue经历伴随时间色移的多步成熟，而amilCP则成熟迅速并保持稳健的光谱稳定性。尽管有这些优点，CPs尚未被系统地评估用于污染物特异性全细胞生物传感，且整合裸眼半定量与微板分光光度定量的标准化方案仍有待开发。
#### 2. 研究目的与内容
基于上述背景，研究人员旨在开发一种双模式汞全细胞生物传感器，通过将解偶联的MerR-Pmer调控电路与热稳定色素蛋白报告基因耦合，实现对无机汞和甲基汞的检测。具体而言，该研究系统地比较了三种候选CPs（aeBlue、amilCP和tsPurple）在大肠杆菌中的异源表达、可溶性和热稳定性，选定amilCP作为最优报告基因。随后通过整合汞转运通道蛋白MerC和有机汞裂解酶MerB实现模块化扩展，分别用于无机汞和甲基汞的检测，最终构建了一个无需有机溶剂萃取、支持裸眼半定量和定量分光光度读数的综合平台，并在真实地表水基质中验证了其实用性。
#### 3. 主要结论与意义
研究结果表明，所选定的amilCP报告基因具备快速成熟、高热稳定性和强烈显色等优势，使传感器能够通过细胞沉淀的RGB图像分析进行半定量，并通过热裂解后的分光光度法进行精确量化。对于无机汞，该平台在成像模式下达到78.125 nM的检测限（LOD），在分光光度模式下达到46.17 nM，动态范围延伸至2500 nM。对于甲基汞，模块化MerB工程产生了互补策略：胞内表达提供痕量级灵敏度（成像LOD约为3.91 nM）；表面展示的InaPb-MerB通过缓解胞内毒性将动态范围扩展至1000 nM；集成的MerC架构则实现了最低检测限（LB培养基中为0.49 nM）。在真实地表水中的基质加标验证获得了Hg(II)成像LOD 39.06 nM和MeHg成像LOD 3.91 nM，确认了分光光度模式的基质耐受性和成像模式的充分筛查能力。该研究证明了基于色素蛋白的全细胞生物传感器可作为连接最小化仪器视觉筛查与仪器辅助定量的经济高效工具，但其更广泛的环境应用仍需在更多样化的基质中进一步验证。
#### 4. 关键技术方法
为实现上述目标，研究人员利用了以下主要技术方法：（1）重组DNA技术构建携带密码子优化的色素蛋白基因和MerR-Pmer调控模块的表达载体；（2）基于SDS-PAGE和全波长扫描的异源表达与可溶性/热稳定性评估；（3）开发标准化热裂解工艺释放胞内蛋白，用于分光光度定量；（4）基于ImageJ软件的沉淀RGB颜色距离分析；（5）模块化基因工程整合merC、merB及inaPb表面展示锚定序列；（6）矩阵验证实验采用真实地表水样品，其采集自深圳洪湖公园，经离心和0.22 μm膜过滤处理后，以90%（v/v）水样与10%（v/v）10×LB肉汤混合作为检测体系。
#### 5. 研究结果与讨论
**5.1 候选色素蛋白的异源表达与可溶性分析**
通过将密码子优化的tsPurple、amilCP和aeBlue克隆至pET-21a衍生的T7lac表达系统并转入大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析确认所有三种构建体均出现约24-26 kDa的过表达条带，与其理论分子质量一致，表明异源表达成功。亚细胞分布分析显示，三种蛋白均主要富集于可溶组分，在包涵体部分积累极少。这种高可溶性对于全细胞生物传感器应用至关重要，因为不溶性聚集体会散射光线并干扰基于吸光度的定量。
**5.2 热稳定性评估与色素蛋白释放标准化**
为建立与微板分光光度法兼容的样品前处理方案，研究人员对酶解后的色素蛋白进行了56°C下0至60分钟的热处理及全波长扫描。结果显示，tsPurple在加热过程中发生明显的光谱位移（吸收峰从530 nm迁移至约580 nm），aeBlue在30分钟时吸收谱趋于稳定，而amilCP在整个60分钟加热过程中在588 nm处保持稳定的吸收最大值，展现出优异的热耐受性。三者的裸眼可见颜色在加热过程中基本保持不变，且特征峰处的吸光度值未随时间显著下降。据此，研究人员确定了56°C下30分钟的标准热裂解方案，该方案足以释放色素蛋白用于下游吸光度测量，同时保留其可见光谱特性。
**5.3 Hg(II)全细胞生物传感器的比较评估与最适报告基因筛选**
研究人员将三种基于不同色素蛋白的报告菌株暴露于0至20000 nM的倍比稀释Hg(II)梯度中，在亚毒性浓度范围内细胞密度保持稳定，仅在高浓度出现明显生长抑制。双模式定量分析显示，在分光光度模式下，所有三种菌株均呈钟形剂量-响应曲线，信号在约5000 nM附近达到峰值后下降；在312.5-2500 nM的拟合范围内，三种菌株的R2分别为0.990、0.999和0.983；基于ICH Q2(R2)校准曲线法计算得到的LOD分别为41.49、46.17和48.44 nM。在RGB成像模式下，tsPurple和aeBlue的响应峰值位于1250 nM，LOD均为39.06 nM；而amilCP的峰值延迟至2500 nM，有效范围延伸至78.125-2500 nM，LOD为78.125 nM。综合热稳定性、光谱一致性和动态范围，amilCP被选为最优报告基因，因其名义上较高的成像LOD相对于其约两倍更宽的动态范围而言是次要的，而后者对于筛查汞浓度变化范围较大的样品至关重要。
**5.4 MerC介导的Hg(II)内流对传感器性能与宿主活力的影响**
为增强胞内Hg(II)积累，研究人员在amilCP传感器基础上引入组成型启动子P637控制的merC基因。然而，MerC的表达从根本上改变了传感器的剂量-响应特征。生长曲线分析表明，该菌株在312.5 nM以下保持正常增殖，但在625 nM及以上浓度出现严重生长抑制，这是由于MerC增强的Hg(II)内流超过了细胞解毒能力。分光光度分析证实其响应峰值左移至625 nM，与亲本菌株的5000 nM相比显著提前。在625 nM及以上浓度，细胞沉淀体积不足以满足RGB分析的最小生物量要求，导致成像模式在较高浓度范围内失效。这一结果与先前报道中MerC引入可大幅提升传感器性能的发现形成对比，反映出16小时色素蛋白成熟积累所需的培养周期与转运增强的Hg(II)内流之间存在时间错配，提示在工程化转运模块时需要平衡灵敏度提升与细胞活力。
**5.5 有机汞裂解酶merB的模块化工程用于甲基汞检测**
为扩展传感器对有机汞的检测能力，研究人员构建了三种互补的生物转化策略：胞内MerB表达（pHg-amilCP-B）、表面展示的InaPb-MerB融合蛋白（pHg-amilCP-surB）以及整合MerC转运通道和表面展示MerB的双功能架构（pHg-amilCP-C-SurB）。三种菌株在测试的MeHg浓度范围内均保持稳定生长，仅在1000 nM及以上出现明显抑制。分光光度定量显示，胞内MerB策略的响应峰值位于250 nM，LOD为23.82 nM；表面展示策略的峰值右移至1000 nM，LOD为18.42 nM；而整合策略的峰值显著左移至15.625 nM，LOD改善至1.19 nM，但有效范围被压缩至1.95313-15.625 nM。RGB成像分析呈现一致趋势：胞内MerB的LOD为3.91 nM，表面展示MerB的LOD为3.91 nM但与胞内MerB相比可将动态范围延伸至1000 nM，整合策略则达到最低的0.49 nM LOD。这些差异反映了生物转化区室化与汞转运策略的根本不同，表明生物转化反应的战略性区室化——无论是胞内、胞外还是整合方式——可用于针对特定监测场景调谐全细胞生物传感器的分析性能。值得注意的是，仪器分析显示三种构型均能达到中国饮用水标准（1 μg/L，约5 nM）所需的检测能力，支持成像模式用于饮用水筛查的适用性。
**5.6 地表水监测中的环境验证与基质兼容性**
研究人员在采集自深圳洪湖公园的真实地表水样中进行了基质加标验证（水样经离心和0.22 μm膜过滤，背景汞浓度低于仪器检测限）。检测体系采用90%（v/v）地表水与10%（v/v）10×LB肉汤的混合比例。结果显示，无机汞传感器TOP10/pHg-amilCP在分光光度模式下于5000 nM处达到峰值响应，有效范围为78.13-5000 nM，LOD为45.95 nM；成像模式的有效范围为39.06-5000 nM，LOD为39.06 nM。两种模式在基质中的灵敏度与纯LB培养基中相当或略有扩展，表明该传感器具有良好的环境适应性且90%基质稀释能有效保留分析性能。对于甲基汞传感器，胞外去甲基化菌株TOP10/pHg-amilCP-surB展现出更强的毒性耐受性，在2000 nM下仍能维持稳健生长；其分光光度LOD为3.76 nM，有效范围为62.5-1000 nM；成像LOD为3.91 nM，有效范围为31.25-250 nM。胞内去甲基化菌株TOP10/pHg-amilCP-B的响应峰值左移至125 nM，分光光度LOD为7.22 nM，成像LOD为3.91 nM。两株菌的成像LOD在基质与纯培养基中保持一致，进一步证实了成像模式在环境相关水样中的适用性。该平台无需有机溶剂萃取的操作优势简化了分析流程并减少了危险废物产生，但研究同时指出，该工作定义的“生物可利用汞”是一个与检测条件绑定的操作性概念，不应被等同于更广义的环境或生物可利用性；且环境验证基于单一地表水样品，需在更多样化的水体中验证以支持更广泛的适用性声明。
#### 6. 讨论与结论
讨论部分强调，色素蛋白报告基因的选择应综合考量热稳定性、光谱一致性和动态范围，而非单一LOD指标。MerC转运通道的引入揭示了灵敏度增强与宿主细胞活力之间的权衡关系，提示未来工程化需优化转运蛋白表达水平或采用诱导型表达以适应报告基因的成熟时间线。MerB模块化工程的不同区室化策略为针对特定浓度范围和样品类型定制传感器性能提供了灵活的工具箱。地表水基质验证证明了色素蛋白传感器在实际环境样品中的稳健性，其无需有机溶剂萃取的特性相较于脱氧紫色杆菌素和靛蓝等色素报告系统具有实用优势。然而，该系统绝对灵敏度仍低于采用MerC转运增强和酶促色素放大级联的DV基传感器，未来可通过优化诱导温度、使用更强启动子或整合转录放大模块来加速amilCP表达，同时不牺牲细胞活力。
研究结论指出，本研究开发了一种基于MerR–Pmer调控电路和优化的色素蛋白报告基因的双模式汞全细胞生物传感器。通过筛选，amilCP因快速成熟、热稳定性和强烈显色而被选为最佳报告基因，可在无需有机溶剂萃取的情况下通过细胞沉淀RGB成像进行半定量，并通过热裂解后的分光光度法进行定量。对于Hg(II)，成像模式LOD为78.125 nM，分光光度法LOD为46.17 nM，动态范围延伸至2500 nM。对于甲基汞，模块化MerB工程产生了互补策略：细胞内表达提供痕量级灵敏度（成像LOD约为3.91 nM），表面展示的InaPb-MerB通过缓解细胞内毒性将动态范围扩展至1000 nM，整合的MerC架构实现了最低检测限（LB培养基中为0.49 nM）。在真实地表水中的基质加标验证获得了Hg(II)成像LOD 39.06 nM和MeHg成像LOD 3.91 nM，确认了分光光度模式的基质耐受性和成像模式的充分筛查能力。该研究论证了色素蛋白全细胞生物传感器作为连接最小化仪器视觉筛查与仪器支持定量的经济有效工具的可行性，但更广泛的环境应用需要在更多样化的基质中进一步验证。
