一种针对蜡样芽孢杆菌及其生物膜和芽孢具有强效裂解活性并在食品基质中展现生物防控潜力的新型裂解性噬菌体WAH2

《Current Research in Food Science》：A novel lytic phage with potent efficacy against Bacillus cereus, its biofilms and spores, and biocontrol potential in food matrices

　　

摘要专业翻译 为应对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus, B. cereus）及其芽孢对食品安全构成的严重威胁，本研究以一株多重耐药B. cereus菌株为宿主，分离并鉴定了一株新型裂解性噬菌体WAH2。形态学观察显示，WAH2具有二十面体头部和可收缩性尾部。该噬菌体可裂解覆盖3种序列型（sequence type, ST）的51株B. cereus菌株中的7株（13.7%）。生物学特性研究表明，WAH2的最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0.0001；其在4–45°C、pH 5–11及2%–10% NaCl条件下均保持稳定；潜伏期为30 min，裂解量为208 PFU/细胞。基因组分析显示，WAH2拥有一个长度为158991 bp、GC含量为37.96%的线性双链DNA基因组，编码284个开放阅读框（open reading frame, ORF）和6个tRNA基因，未检测到抗生素耐药基因、毒力因子或溶原性相关元件。WAH2被归类为Herelleviridae科Bastillevirus属的一个新种。体外实验表明，WAH2能强烈抑制宿主菌生长（36 h内无再生长），显著减少生物膜形成并破坏成熟生物膜，同时有效抑制萌发芽孢的芽管形成。重要的是，在牛奶、米饭和猪肉等食品基质中，WAH2在25°C和4°C下均以剂量和时间依赖性方式显著减少或完全消除B. cereus，且未观察到再生长。在TSB和牛奶中，WAH2持续存活120 h，且未检出抗性存活菌。综上，WAH2是一种安全、高效且具有应用前景的噬菌体，可作为食品中B. cereus生物防控的候选菌剂。

论文解读

一、研究背景与研究意义

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus, B. cereus）是一种常见的食源性病原菌，广泛存在于牛奶、米饭、肉制品及即食食品中。该菌可产生肠毒素和呕吐毒素，引发呕吐和腹泻等症状，对食品安全和公共卫生构成严重威胁。全球范围内，B. cereus约占细菌性食源性疾病暴发的1.4%–12.0%；在欧洲，其与306起暴发和3192例病例相关；在中国，2010至2020年间共报告419起食源性暴发，导致7892例病例、2786例住院和5例死亡。B. cereus形成芽孢和生物膜的能力显著增强了其在食品和环境中的适应性与持久性。芽孢对热、干燥及酸碱胁迫具有显著抗性，难以从食品中彻底清除；在适宜条件下，芽孢萌发为营养细胞，成为后续污染的源头。此外，B. cereus易在食品加工表面形成生物膜，进一步增强其对消毒剂和环境胁迫的抵抗力，导致持续性污染。多重耐药菌株在食品中日益流行，进一步增加了防控难度。传统物理和化学方法虽可部分降低风险，但成本较高且可能损害食品感官品质。因此，开发经济、安全、有效的替代策略迫在眉睫。噬菌体因其生产成本低、宿主特异性高、可自我复制及安全性好，被视为食品生物防控的理想工具。然而，目前靶向B. cereus的噬菌体资源仍相对匮乏，尤其是兼具强裂解能力、良好环境稳定性和食品基质高效表现者更为稀缺。本研究旨在分离和表征一株新型裂解性噬菌体WAH2，系统评估其形态学、生物学、基因组学特征及其在食品基质中的生物防控效能，以丰富B. cereus噬菌体资源，为基于噬菌体的食品生物防控策略提供科学依据。

二、主要技术方法

研究人员从广州某食品工厂污水处理设施采集污水样本，以多重耐药B. cereus菌株BY118LC为宿主，通过富集培养和双层琼脂法分离纯化噬菌体WAH2。采用透射电子显微镜观察其形态；通过点斑实验和铺板效率测定评估宿主范围；通过最佳感染复数、稳定性测试、一步生长曲线和吸附实验表征其生物学特性。利用Illumina NovaSeq 6000平台进行全基因组测序，经SPAdes组装、Bakta注释，并通过BLASTp、tRNAscan-SE、CARD和VFDB数据库分别进行功能注释、tRNA筛选、耐药基因和毒力因子筛查。采用VIRIDIC和基于大终止酶亚基的系统发育分析进行分类鉴定。体外实验包括生长抑制、生物膜预防与破坏、芽孢抑制及时间杀菌曲线。食品基质实验选用UHT全脂牛奶、米粉和猪肉，在25°C和4°C下评估不同MOI的抗菌效果。噬菌体持久性和抗性分析在TSB和UHT牛奶中进行，持续120 h。

三、研究结果

3.1 噬菌体WAH2的分离与形态学特征

以B. cereus BY118LC为宿主分离获得噬菌体WAH2，其在菌苔上形成清晰、均匀、圆形噬菌斑，平均直径为1.78 ± 0.18 mm。透射电镜显示其具有直径88.28 ± 2.11 nm的二十面体衣壳和长度199.44 ± 6.62 nm的可收缩尾部，符合肌病毒样形态。

3.2 宿主范围与铺板效率

斑点实验显示WAH2可裂解51株B. cereus中的7株（13.7%），其中4株呈清晰裂解区、3株呈浑浊裂解区。所有阳性菌株均可在双层琼脂实验中形成可见噬菌斑，确认产毒性感染。相对宿主BY118LC的EOP值介于0.013至0.564之间。易感菌株分布于ST2818、ST2821和ST395三个序列型。WAH2对所有测试的非靶标细菌均无裂解作用，表明其裂解谱较窄。

3.3 噬菌体WAH2的生物学特性

最佳MOI为0.0001，最高滴度达1.6×10⁸ PFU/mL。WAH2在4–45°C范围内活性稳定，55°C时随时间延长滴度逐渐下降，65°C及以上完全失活。其在2%–10% NaCl浓度范围内活性稳定，在pH 5–11范围内保持高活力，pH 2和13时完全失活。一步生长曲线显示潜伏期为30 min，裂解量为208 PFU/细胞。吸附实验显示5 min内吸附率约44.05%，20 min时达78.89%。

3.4 基因组与系统发育分析

WAH2基因组为158991 bp线性双链DNA，GC含量37.96%，编码284个ORF（71个功能已知、213个假设蛋白）和6个tRNA基因。功能ORF分为DNA复制与调控、结构与组装、包装和裂解模块。未检测到抗生素耐药基因、毒力因子或溶原性元件。BLASTn分析显示WAH2与Bacillus噬菌体OTooleKemple52和Kamfam共享92.47%核苷酸一致性（92%覆盖率）。VIRIDIC分析将其与OTooleKemple52、Kamfam和Bastille聚类。基于大终止酶亚基的系统发育树将WAH2置于Bastillevirus属内，支持其作为该属新种的分类地位。

3.5 裂解活性、生物膜预防与破坏

在TSB中，WAH2对B. cereus BY118LC呈剂量依赖性抑制。MOI为1000、100和10时，36 h内细菌生长完全受抑；MOI为1和0.1时，虽有轻微初期生长，但随后增殖停滞，实验结束时无再生长。WAH2显著抑制生物膜形成，MOI为1000至0.1时，生物膜量（OD₅₉₀）分别减少0.66 ± 0.04至0.57 ± 0.05。在不锈钢片预形成48 h的成熟生物膜经10⁷和10⁸ PFU/mL WAH2处理12 h后，生物膜量分别减少1.07 ± 0.04和0.99 ± 0.07，生物膜相关活菌数分别减少3.84 ± 0.06和3.68 ± 0.19 log₁₀ CFU/mL。

3.6 噬菌体WAH2抑制萌发芽孢的芽管形成

在TSB中，对照组芽孢正常萌发生长，约10 h后进入稳定期；所有MOI的噬菌体处理组在12 h内OD₆₀₀均无升高，表明WAH2有效抑制了营养条件下芽孢的生长。在0.85% NaCl溶液中，噬菌体处理组与对照组菌数均无明显变化，说明WAH2不能直接灭活休眠芽孢。萌发实验显示噬菌体处理组与对照组OD₆₀₀变化无显著差异，表明WAH2不影响芽孢萌发过程。12 h培养物涂板结果显示，对照组未热处理菌数比热处理高约4 log₁₀ CFU/mL，而噬菌体处理组两者无显著差异，证实WAH2抑制了萌发芽孢的芽管形成。

3.7 多种食品基质中的生物防控效果

在25°C下，未处理对照组细菌快速增殖，噬菌体处理组菌数呈剂量依赖性下降。牛奶中，MOI为10000和1000时3 h内菌数降至检测限以下，MOI为100时6 h内降至检测限以下。米饭中，相应MOI分别于3、6和24 h达到不可检出水平。猪肉中，MOI为10000时12 h内完全消除，MOI为1000和100时72 h分别减少6.68和1.66 log₁₀ CFU/g。72 h内未观察到细菌再生长。在4°C下，对照组菌数相对稳定，但WAH2仍呈剂量依赖性抑制细菌生长。牛奶中，MOI为10000时12 h内降至检测限以下，MOI为1000时24 h内降至检测限以下，MOI为100时72 h减少1.14 log₁₀ CFU/mL。米饭中，MOI为10000时48 h内不可检出，MOI为1000和100时72 h分别减少1.80和0.59 log₁₀ CFU/mL。猪肉中，MOI为10000、1000和100时72 h分别减少2.12、0.85和0.15 log₁₀ CFU/g。所有处理组均未检测到细菌再生长。

3.8 TSB和UHT牛奶中的噬菌体持久性与抗性

在4°C下，WAH2在TSB和UHT牛奶中120 h后滴度仅分别下降0.425和0.320 log₁₀ PFU/mL；25°C下分别下降0.808和0.677 log₁₀ PFU/mL。所有条件下120 h时仍可检出感染性噬菌体。抗性分析中，25°C下噬菌体处理组自24 h起在无噬菌体TSA上未检出活菌；4°C下处理组各时间点菌数均显著低于对照组。值得注意的是，任何组别在任何时间点均未在含WAH2的TSA上检出抗性菌落，抗性频率低于检测限。

四、讨论与结论

讨论部分指出，WAH2作为Bastillevirus属新种，其基因组不含溶原性、毒力或耐药相关基因，安全性良好。其极低的最佳MOI（0.0001）有利于降低生产成本；30 min潜伏期和208 PFU/细胞的裂解量表明其复制效率高；4–45°C、pH 5–11和2%–10% NaCl的宽泛稳定性优于已报道的多种B. cereus噬菌体。虽然宿主范围较窄（13.7%），但所有易感菌株均为多重耐药菌且分布于不同序列型，该特异性有利于噬菌体鸡尾酒制剂的开发。WAH2最突出的特征是其持续抗菌活性——36 h内无细菌再生长，且120 h内未检出抗性存活菌，这与多种已报道噬菌体出现再生长形成鲜明对比。WAH2兼具抑制生物膜形成和破坏成熟生物膜的双重活性，对不锈钢表面生物膜相关菌数减少近4个数量级。在芽孢控制方面，WAH2不能直接灭活休眠芽孢也不影响萌发，但能有效抑制萌发芽孢的芽管形成，提示单一噬菌体策略难以完全根除芽孢，未来应探索萌发剂与噬菌体联合使用的策略。在食品基质中，WAH2在25°C和4°C下均表现出优于多数已报道噬菌体的快速、持续抗菌效果，尤其在结构复杂的猪肉基质中仍能高效杀灭细菌。讨论也指出其应用局限性，包括宿主范围窄、食品基质中均匀递送困难以及实验食品经预处理等，并提出构建噬菌体鸡尾酒、改造尾纤维蛋白和食品级材料包被等未来研究方向。

研究结论：本研究分离并表征了一株针对B. cereus的新型裂解性噬菌体WAH2。WAH2宿主范围相对较窄，但具有较强的环境耐受性和复制能力。基因组分析将其归入Herelleviridae科Bastillevirus属，未检测到抗生素耐药基因、毒力基因或溶原性相关元件，表明其生物安全性高。WAH2表现出强裂解活性，36 h内无细菌再生长，并显著抑制生物膜形成和破坏成熟生物膜。此外，WAH2不能直接灭活休眠芽孢也不影响芽孢萌发，但显著抑制萌发芽孢的芽管形成。值得注意的是，WAH2在25°C和4°C下均能有效抑制牛奶、米饭和猪肉中B. cereus的生长，且无再生长现象。在TSB和牛奶中，WAH2持续存活120 h且未检出抗性存活菌。综上，WAH2是一种安全有效的生物防控候选菌剂，在控制食品中B. cereus污染方面具有良好的应用潜力。