生鲜农产品超声清洗中微生物持留：从细胞与群落存活机制到控制策略

《Current Opinion in Food Science》：Microbial persistence during ultrasonic washing of fresh produce: from survival mechanisms to control strategies

　　

超声（ultrasound）因具有环境友好和非热特性，正越来越多地应用于生鲜农产品清洗。然而，微生物灭活不完全可使存活的微生物在处理后持留。本综述总结了细胞和群落水平上微生物持留（microbial persistence）的机制。持留源于声场异质性（acoustic field heterogeneity）、空化不均匀、复杂的果蔬表面结构以及微生物对超声胁迫的适应性响应。在细胞水平，存活涉及膜重塑、胁迫适应、亚致死损伤以及活的非可培养（viable but non-culturable，VBNC）细胞的形成。在群落水平，细胞聚集和生物膜形成进一步保护微生物并促进再定殖。减少持留的策略包括优化声场以及将超声与化学试剂或其他非热技术联用。未来整合微生物生理学、超声工程和人工智能，可能改善对复杂生鲜农产品清洗系统中微生物持留的预测和控制，同时平衡微生物灭活、产品品质和加工效率。

论文解读文章

鲜切蔬菜因具有新鲜和即食特征在全球日益流行。与热处理食品不同，鲜切果蔬不经过热杀菌，其微生物安全在很大程度上依赖贮藏和清洗等初级加工步骤。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）和美国疾病控制与预防中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的监测报告显示，近年来受病原微生物污染的鲜切蔬菜相关食源性疾病暴发频繁发生。尽管常规清洗程序可去除生鲜农产品表面污染物，但其剥离和灭活附着微生物的能力仍有限。为在清洗中改善微生物控制，同时保持生鲜农产品感官品质并减少环境影响，多种非热加工技术被引入生鲜农产品清洗系统。其中，超声（ultrasound）因其独特空化（cavitation）效应、环境友好和非热干预特点而受到关注，并逐渐用于工业果蔬清洗。然而，不断积累的证据表明，单独超声处理不足以实现完全微生物去除或灭活。因此，部分微生物可在处理后存活，并保留恢复、增殖或造成后续污染的能力，这一现象被称为微生物持留（microbial persistence）。持留并非单一生理状态，而是包括处理后多种存活状态，如完全存活、亚致死损伤（sublethal injury）和活的非可培养（viable but non-culturable，VBNC）细胞。这些存活群体在有利条件下可恢复和增殖，从而构成潜在食品安全风险。

研究人员围绕超声处理后微生物持留现象开展综述，总结超声胁迫下细菌存活机制，包括声场异质性、微生物胁迫响应和生物膜相关保护，并讨论减轻微生物持留、提高超声去污系统效力的新兴策略。该综述得出，超声单独灭活效果有限，多数研究中微生物减少量仅为0.5–2.5 log CFU g^?1或mL^?1；持留由声场分布不均、空化盲区、生鲜农产品复杂表面结构以及微生物适应和生物膜保护共同促成。其意义在于，未来需整合微生物生理学、超声工程和人工智能，以预测和控制复杂生鲜农产品清洗系统中的微生物持留，同时平衡微生物灭活、产品品质和加工效率。

主要关键技术方法：本综述为叙述性综述，不是原始实验研究。研究人员基于已发表文献，汇总单独超声在生鲜农产品中灭活微生物的效果；采用文献中声场模拟、声发射强度测定、铝箔空化侵蚀、空间映射、气泡动力学模拟和高速成像等技术证据；利用转录组、蛋白质组、膜通透性、细胞形态和共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）分析细胞适应与损伤；结合多频/扫频超声、换能器配置优化、超声与化学试剂、紫外-C（ultraviolet-C，UVC）、没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、脉冲控制等离子体活化水等联合策略；并提及Taguchi实验设计与机器学习预测动态超声辅助清洗中微生物变化。未涉及样本队列来源。

研究结果

超声的作用机制（Mechanism of action of ultrasound）：超声的微生物灭活效应主要归因于声空化。超声波的交替压缩和稀疏循环中，空化泡形成、快速膨胀并在达到临界尺寸后崩溃，产生局部高温高压、强剪切力和活性氧（reactive oxygen species，ROS），破坏细菌细胞壁和膜并诱导氧化损伤，最终导致微生物灭活。汇总研究显示，单独超声可降低生鲜农产品表面微生物载量，但灭活效力通常有限，多数研究报道减少量仅为0.5–2.5 log CFU g^?1或mL^?1，表明相当比例微生物可能存活。传统上，这种存活主要归因于加工参数欠佳或空化强度不足；但越来越多证据表明，非均匀声能分布与微生物胁迫适应之间的相互作用也导致微生物存活差异和超声处理总体灭活效率变化。

超声场分布不均（Uneven distribution of ultrasonic fields）：通过COMSOL模拟、声发射强度测定、铝箔空化侵蚀、空间映射和气泡动力学模拟等研究得出，声能分布和杀菌盲区是决定微生物灭活效果的主要因素。靠近换能器区域声压和空化强度较高，远离换能器区域降低；超声在罐壁、液面和浸没物体界面发生反射、散射和干涉，在固定频率下易形成驻波，导致节点和反节点间声压空间变化。在450 W和44 kHz条件下，不同测量平面空化强度约为38.75–64.4 W/cm²，说明局部空化活动差异显著并造成杀菌盲区。处理具有复杂表面结构的生鲜农产品时，声场空间异质性更明显。蔬菜表面的皱褶、多孔和裂隙微结构可形成局部受限空间，改变空化泡形成、聚集和崩溃；表面粗糙度、润湿性和组织结构也影响微生物空间分布和附着，使不同位置细胞承受不同超声胁迫。工业清洗中蔬菜堆叠和相互遮蔽产生声影效应，限制被遮挡表面暴露于超声能量，显著抑制声波传播和空化活动，降低微生物灭活效率。因此，远离换能器且被产品结构几何遮蔽的区域常成为超声杀菌盲区，其中微生物更易存活，单纯增加处理时间或超声功率改善有限。

微生物对超声胁迫的适应（Microbial adaptations to ultrasonic stress）：通过膜生理、转录组和蛋白质组等研究得出，由于超声场分布不均和生鲜农产品表面微结构，处理系统中不同位置微生物细胞暴露于不同水平机械应力和声化学效应，其细胞响应高度异质，并与膜稳态扰动和胁迫响应通路激活密切相关。超声处理可改变膜通透性、膜流动性和膜电位，从而破坏正常细胞功能。为维持膜完整性和基本膜相关过程，细菌激活适应性胁迫响应，通过调节脂肪酸代谢、磷脂生物合成和脂多糖合成途径进行膜重塑。转录组研究进一步表明，超声胁迫可重编程物质运输和中心碳代谢相关基因；与氯处理相比，超声诱导不同转录响应，提示细菌对超声胁迫的适应不同于对常规化学胁迫的适应。快速机械扰动可改变膜张力并激活机械敏感通道，如MscL和MscS，促进胞内溶质释放以缓解膜张力并减少膜损伤。在亚致死超声胁迫下，细菌细胞可出现膜破坏、部分蛋白变性和代谢活性降低，但未完全灭活。这些亚致死损伤细胞保留不同程度修复能力，并可在有利环境条件下通过膜修复和胞内稳态恢复等机制恢复生理功能。因此，亚致死损伤应被视为细胞功能暂时破坏，而非不可逆微生物灭活。除亚致死损伤外，超声胁迫还可触发与损伤修复和代谢调节相关的适应响应，可能促进亚群细胞进入VBNC状态。蛋白质组分析显示，热超声诱导的VBNC细胞在核糖体功能、细胞包膜修复和能量代谢相关蛋白方面发生协调变化，提示细胞可能调节蛋白合成和基础代谢活性以维持基本生存功能，同时抑制细胞增殖。然而，其代谢活性仍不足以支持细胞分裂和在常规培养基上形成菌落。重要的是，VBNC细胞在环境条件有利时可恢复可培养性和正常生理功能。亚致死损伤和VBNC细胞的存在导致超声处理中常观察到非线性细菌灭活动力学，并在存活曲线中形成特征性拖尾现象，限制杀菌效率。这些细胞在细胞损伤程度和代谢活性方面不同，因此表现出不同恢复动态和存活能力。在生鲜农产品清洗中，一些细胞可快速恢复，而损伤或VBNC细胞在环境条件有利时逐渐恢复。这种异质性可使微生物在洗水和产品表面持留，增加后续再定殖潜力。因此，超声处理后微生物持留不仅取决于单个细胞生理状态，也取决于不同生理状态细胞的共存和相互作用，为在群体水平理解持留提供基础。

群落水平微生物持留（Microbial persistence at the community level）：通过比较浮游细胞与群落形式的研究得出，多数实验系统主要研究浮游细胞对超声胁迫的响应，但在生鲜农产品清洗中，微生物通常以细胞聚集体或生物膜（biofilm）形式定殖于产品表面，而非单个细胞。与浮游细胞相比，这些微生物群落可通过细胞黏附、细胞间相互作用和生物膜形成增强集体存活，使部分群体在超声处理后存活。若干研究报道，低强度超声可增加Bifidobacterium spp.和Lacticaseibacillus casei ATCC 393等微生物的细胞表面疏水性；由于表面疏水性是控制初始微生物附着的重要理化性质，这种变化可能影响微生物与生鲜农产品表面相互作用，并可能影响后续生物膜形成。尽管超声可在一定程度上破坏和剥离生物膜，但通常不足以实现完全生物膜去除或灭活。超声处理效果强烈依赖操作参数、生物膜成熟度以及胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）组成和结构。成熟生物膜通常含更厚EPS基质和更复杂三维结构，可限制超声穿透，导致外层损伤更大而深层区域细胞受保护。生物膜还存在营养、氧和代谢活性梯度，使不同空间位置细胞处于不同生理和胁迫状态。例如，深层生物膜中氧和营养扩散有限可降低细胞代谢活性，并可能降低对超声胁迫的敏感性。EPS成分包括多糖、蛋白质和胞外DNA，共同决定生物膜结构和机械稳定性。这些空间和结构差异可能导致生物膜群落内异质存活。然而，超声通过改变细胞生理状态进一步影响生物膜持留的证据仍有限，仍需研究单细胞超声响应与生物膜群体内持留存活之间的关系。处理后存活微生物还可继续在产品表面和洗水之间迁移。超声可促进附着微生物剥离，而未完全灭活细胞可进入洗水，成为后续清洗产品的污染源。当洗水在多批次中回用时，存活微生物可在产品表面和洗水之间反复转移，使持留从单次处理后的残余污染扩展为清洗系统内持续存活和跨批次传播。因此，单纯提高超声强度或处理时间可能不足以消除微生物持留，优化超声条件并整合补充控制策略可能是进一步降低微生物存活和传播的必要措施。

减轻超声过程中微生物持留的策略（Strategies for mitigating microbial persistence during ultrasound）：通过声场调控和联合处理研究得出，针对声场异质和超声杀菌盲区，近期研究主要集中于改善声场均匀性和开发协同处理策略。从声场调控角度，多频和扫频超声被认为是改善超声系统能量分布的有效方法。通过同时或顺序运行多个频率，这些技术改变超声波干涉和叠加模式，减少单频条件下常见的驻波节点形成，从而使声能更均匀分布于处理系统，减少杀菌盲区。例如，Zhang等使用扫频超声处理花椰菜，使微生物减少量从单频超声约0.5–0.6 log CFU/g提高到约1.2–1.3 log CFU/g。此外，优化换能器配置可进一步改善声场均匀性。例如，对称换能器排列可改变超声波传播和反射路径，导致更均匀声压分布，并增强超声清洗过程中的微生物灭活效率。近年来，联合处理策略受到更多关注。与单独超声相比，联合处理通常实现更强微生物灭活。例如，单独超声仅使E. coli减少0.48 log CFU/mL，而微酸性电解水减少约3.00 log CFU/mL；二者联合使减少量达3.64 log CFU/mL。膜通透性、细胞形态和CLSM分析进一步支持其协同抗菌效应。类似地，将食品级声敏剂PG与高频超声联合处理15分钟，使水苹果汁中Listeria innocua和E. coli O157:H7减少约5.5 log CFU/mL。与任一单独处理相比，联合处理诱导更强膜破坏和氧化应激，支持协同抗菌机制。超声还可与UVC等其他非热技术联用以增强微生物灭活。超声–UVC联合处理对成熟生物膜实现5.2–5.6 log CFU/cm²的减少，显著高于单独超声实现的1–4 log CFU/cm²减少。然而，控制微生物持留仅关注即时灭活可能不足。研究显示，超声与氯联合处理将VBNC群体降至仅10^1.3 CFU/mL，显著低于单独超声的10^3.6 CFU/mL和单独氯处理的10^5.2 CFU/mL，同时抑制VBNC细胞后续恢复。类似地，超声与紫外辐照联合可分散微生物聚集体，减少局部屏蔽效应，并增强深层生物膜细胞灭活，从而降低潜在存活者残余群体。在生鲜农产品清洗系统中，超声与脉冲控制等离子体活化水联合也可减少清洗过程中交叉污染。这些发现表明，联合处理的价值不仅在于提高即时灭活效率，还在于通过靶向潜在存活群体包括VBNC细胞，减少处理后微生物持留。尽管如此，联合超声技术在生鲜农产品清洗中的实际应用仍受设备成本和产品品质潜在影响限制。多频超声及其与其他非热技术联用通常需要额外换能器或处理模块，增加设备、运行和维护成本。此外，超声对生鲜农产品品质的影响具有工艺依赖性，过强强度或过长处理可能导致组织软化、表面损伤和颜色变化。因此，实际实施需要仔细优化，以平衡微生物控制、设备成本、加工条件和产品品质。

结论（Conclusion）翻译与总结：超声被广泛认为是环境友好和非热处理技术，并已越来越多地用于工业果蔬清洗系统。然而，由于声场分布异质、空化盲区和生鲜农产品复杂表面结构，完全微生物灭活仍难以实现，这些因素共同促进存活微生物持留和潜在恢复。未来研究应进一步阐明声场条件与微生物存活之间的关系，并确定单细胞异质性如何促成群体水平上的持留存活。清洗过程中声场、生鲜农产品表面特征和微生物响应之间的复杂互作也为基于人工智能（artificial intelligence，AI）的预测和优化创造了机会。一项研究将Taguchi实验设计与机器学习结合，用于预测鲜切蔬菜动态超声辅助清洗过程中的微生物变化。未来模型可进一步整合超声参数、产品表面特征和空化活动，以预测局部声学效应并识别复杂产品表面处理不足区域，从而指导工艺优化。最终，研究应从最大化即时微生物灭活转向预测和控制微生物持留，同时平衡加工效力、设备成本和生鲜农产品品质。