用于基于宿主反应的脓毒症诊断的多重蛋白酶活性谱分析

《Clinica Chimica Acta》：Multiplexed protease activity profiling for host response-based Sepsis diagnosis

　　

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  质量编码基质实现了蛋白酶活性的高效多重检测。
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  血浆蛋白酶特征谱可区分脓毒症与非脓毒症。
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  该检测在3小时内实现了87.5%的准确率和88.0%的灵敏度。

引言

脓毒症是一种由机体对感染的失调性反应引起的危及生命的疾病，可导致器官功能障碍，若未及时治疗则会导致死亡。尽管重症监护领域取得了进展，脓毒症仍是全球主要的死亡和发病原因，估计每年导致1100万人死亡，约占全球死亡人数的20%[1]。早期诊断和及时干预对于改善预后至关重要；然而，目前的诊断方法在速度、特异性和可操作的临床实用性方面仍存在不足[1]。

传统的脓毒症诊断方法通常依赖临床评分系统（如SOFA、qSOFA）、微生物培养和C反应蛋白（CRP）及降钙素原（PCT）等非特异性生物标志物[2]。虽然血培养是病原体鉴定的金标准，但其耗时较长（通常需要24至72小时），灵敏度较低，且常出现阴性结果，尤其是当患者已接受经验性抗生素治疗时。此外，非病原特异性生物标志物在区分感染性与非感染性炎症或根据疾病严重程度和进展对患者进行分层方面缺乏足够的灵敏度和特异性[2]。

人类蛋白酶在脓毒症期间的宿主免疫反应中发挥着核心作用。这些酶，特别是中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（如人中性粒细胞弹性蛋白酶[HNE]）和基质金属蛋白酶（如MMP8和MMP9），在中性粒细胞激活期间释放，参与组织重塑、微生物清除和炎症信号传导[3]。然而，在脓毒症中，其活性可能发生失调，从而导致过度的组织损伤、血管渗漏和多器官衰竭[4]。重要的是，其活性水平（而不仅仅是其丰度）可提供脓毒症病理过程的实时信息，包括疾病的起始和严重程度。利用蛋白酶活性作为诊断标志物为脓毒症检测提供了一种新颖且可能具有变革性的方法[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。蛋白酶活性分析的最新进展包括DNA条码化等离子体传感器、基于活性的拉曼纳米探针以及基于TOF探针的质量细胞术，实现了跨生物学尺度的灵敏、多重测量。相关研究已采用有机质量标记和含聚乙二醇（PEG）的纳米结构进行生物标志物定量和细胞内蛋白酶活性测量。与传统蛋白质标志物不同，后者以延迟的方式反映基因表达或免疫激活，蛋白酶活性可即时反映酶功能和炎症反应[10]。由于蛋白酶失调发生在脓毒症病理生理的早期，测量特定蛋白酶活性将允许更快且具有机制信息量的诊断。此外，靶向蛋白酶活性的功能检测与传统基于抗原或核酸的诊断方法本质上不同，因为它捕捉了动态的生物学过程，这可能更好地与临床病程和治疗反应相关[11]。

尽管取得了这些进展，重叠的基质特异性使得复杂生物样本中蛋白酶活性的解读变得复杂。在上述方法的基础上，我们将特定长度的PEG-肽基质与MALDI-TOF MS直接检测不同切割产物相结合，以生成用于脓毒症评估的多重活性谱。我们开发了一种创新方法，通过整合蛋白酶基质的修饰来提高其特异性，从而准确测量蛋白酶活性，并允许在单次多重检测中定量多种蛋白酶[12]。我们将靶向HNE和MMPs的多重检测应用于脓毒症和非脓毒症患者的血浆样本。我们的研究结果表明，使用该检测方法可以很好地表征不同的蛋白酶活性特征谱。重要的是，该检测实现了具有快速周转时间的诊断性能。鉴于其快速的周转时间、低的运行成本和高特异性，我们预期该平台有可能大幅变革当前的脓毒症诊断实践。

章节摘要

多重蛋白酶活性检测的开发

我们设计新型蛋白酶基质用于多重蛋白酶活性检测的方法，源于常规报道的由人类蛋白酶切割的肽序列。为了提高这些基质的分析能力，我们将每种肽偶联到一个聚合物分子上，主要是聚乙二醇（PEG）（图1A）。暴露于人类蛋白酶时，聚合物连接的基质被切割，但由于人类蛋白酶的 [非特异性]，切割特异性相对较宽。

讨论

采用定制基质传感器与MALDI-TOF MS结合的多重蛋白酶活性检测，代表了蛋白酶活性分析在临床诊断应用中的一项重大突破。传统的基于荧光的蛋白酶活性测量方法存在局限性，因为它们将不同蛋白酶产生的多次切割事件的信号整合为单一读数，无法区分个体蛋白酶的活性[13]、[14]、[15]。在

研究设计

我们最初开发了一种多重蛋白酶活性检测，并使用一组重组人蛋白酶面板对其进行分析评估，以确认该检测能够检测和区分个体蛋白酶活性的能力。在验证之后，我们将该检测应用于从诊断为脓毒症或非脓毒症的患者中获得的血浆样本，以评估该检测在基于不同[特征]区分脓毒症和非脓毒症病例方面的临床相关性和诊断性能。

CRediT作者贡献声明

Emily R. Caton：形式分析。Yezhi Pan：数据整理。Kiana M. Kiser：形式分析。Caroline R. Haddaway：形式分析。Wayne A. Bryden：项目管理。Michael McLoughlin：项目管理。Marek A. Mirski：概念化。Robert H. Christenson：方法学。Cindy C. Sevilla：形式分析。Shuo Chen：调查研究。Sheng Feng：写作——审阅与编辑、写作——原始草稿、方法学、调查研究、形式分析、概念化。Dapeng Chen：写作

资金支持

美国国立卫生研究院资助 R44AI177245(DC)。

利益冲突声明

作者声明他们不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

无。

Emily R. Caton | Yezhi Pan | Kiana M. Kiser | Caroline R. Haddaway | Wayne A. Bryden | Michael McLoughlin | Marek A. Mirski | Robert H. Christenson | Cindy C. Sevilla | Shuo Chen | Sheng Feng | Dapeng Chen