负载脑源性神经营养因子的温敏性壳聚糖/丝素蛋白/聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷酮水凝胶促进卒中后的功能恢复

《Biomaterials Advances》：Thermoresponsive chitosan/silk fibroin/PVA/PVP hydrogel loaded with BDNF promotes functional recovery after stroke

　　

## 摘要

• 开发了一种热响应型壳聚糖/β-甘油磷酸盐/丝素蛋白/聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷酮复合水凝胶，用于卒中后脑修复。
• 优化的水凝胶（F6）表现出在生理温度下的快速凝胶化、微孔结构、生物相容性和体外可生物降解性。
• 在光血栓性卒中小鼠模型中脑内植入F6水凝胶后，卒中后2周或8周均未减少梗死体积。
• F6水凝胶可减轻反应性星形胶质细胞增生和微胶质细胞活化，并促进卒中后神经发生。
• 载有脑源性神经营养因子（BDNF）的F6水凝胶显著改善了卒中后的长期功能恢复。

## 引言

卒中仍然是全球范围内导致成人残疾的主要原因，这主要是由于成体中枢神经系统的再生能力有限[1],[2]。损伤后形成的不友好微环境阻碍了有效疗法的发展，难以促进卒中后的结构和功能恢复[2]。再灌注治疗，包括静脉溶栓和机械取栓，在缺血性卒中急性期成功实施时可显著改善预后[3],[4]。然而，尽管成功的再灌注可以限制缺血性损伤，但再灌注治疗主要针对卒中急性期脑血流的恢复，并非专门设计用于促进卒中慢性期的组织重塑和神经再生[5]。此外，由于治疗窗口狭窄、禁忌症以及获得专业卒中护理的困难，只有少数患者能从中受益，许多患者仍面临长期残疾的风险[1],[6]。因此，迫切需要再生策略来调节卒中后微环境并促进持久的组织再生和功能恢复。

缺血性损伤后，梗死灶周围的细胞外和细胞微环境经历广泛重塑。反应性星形胶质细胞、活化的微胶质细胞以及细胞外基质（ECM）成分的变化共同形成了围绕梗死灶的致密胶质瘢痕，限制轴突重塑、神经可塑性和内源性修复[2],[7],[8]。可注射水凝胶为改变该环境提供了一种潜在策略，因为它们可通过微创手术递送至受损脑组织，并能适应梗死腔的不规则几何形状[9],[10],[11],[12]。此外，可注射水凝胶可以提供临时结构支撑，并作为局部递送细胞或治疗分子的血库[13],[14],[15]。重要的是，先前的研究已证明生物材料可以独立于所携带的治疗剂而发挥生物学效应。例如，将微孔水凝胶植入卒中腔已被证明可减轻胶质增生和炎症，并影响神经祖细胞的增殖和迁移[10]。将一种可注射脑细胞外基质水凝胶植入大鼠脑内出血的卒中腔也可促进运动功能、增强血管生成和内源性神经祖细胞迁移[16]。这些观察结果表明，植入水凝胶的物理和生化特性本身即可影响卒中后微环境中的细胞反应。

植入水凝胶的生物学反应强烈依赖于其理化特性，包括凝胶化动力学、刚度、孔隙率和降解行为[17],[18]。机械相容性对于神经应用尤为重要，因为脑组织天然柔软，水凝胶刚度可影响神经祖细胞分化、神经突生长和胶质细胞反应[19]。因此，植入水凝胶应提供足够的机械完整性以保持局部留存，同时避免相对于周围神经组织过于僵硬[14]。这些参数对于脑内应用尤其重要，因为材料必须可注射且不造成显著组织损伤、给药后保持局部定位、具有与柔软神经组织相容的机械特性，并提供足够的孔隙率以实现分子转运和组织相互作用[20]。然而，在单一可注射材料中同时实现这些特性仍具有挑战性。例如，主要为快速凝胶化优化的水凝胶可能表现出对神经组织应用不利的机械或微结构特性。因此，在保持热响应可注射性的同时系统地调节多种材料特性，代表了卒中后生物材料的重要设计目标。

壳聚糖（CS）/β-甘油磷酸盐（β-GP）水凝胶因其能在接近生理温度下发生温度依赖性的溶胶-凝胶转变，而成为脑内递送的有吸引力候选材料，允许以液态形式注射后在体内原位凝胶化[21],[22],[23]。在我们先前的工作中，我们优化了CS/β-GP的组成，确定了一种含有0.75% CS和3% β-GP的配方，具有热响应和细胞相容特性，适用于可注射神经组织工程应用[24]。然而，单独的CS/β-GP水凝胶在机械和生物学特性方面提供的可调节性有限[25]。先前的研究已引入其他生物高分子，如胶原蛋白、明胶、丝素蛋白（SF）、透明质酸和羟基磷灰石，以拓宽CS/β-GP水凝胶的机械和组织修复特性[26],[27]。

为开发神经修复的再生疗法，胶质瘢痕的形成是一个重要障碍，同时也是其他挑战之一。多种策略，如在"水凝胶中掺入抗炎药物和/或特异性信号分子，已被用于增强水凝胶的生物学功能。丝素蛋白（SF）是一种天然聚合物，具有优异的生物相容性、调节水凝胶结构和生物学功能的能力。此前，我们和其他研究者已证明将丝素蛋白（SF）基材料植入梗死腔可防止卒中后胶质瘢痕形成[28],[29]。因此，将SF掺入CS/β-GP水凝胶提供了一种稳定且经济有效的方法来增强CS/β-GP水凝胶的生物学功能。聚乙烯醇（PVA）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是具有增强粘弹性行为的生物相容性合成聚合物[30],[31],[32],[33]。因此，我们试图确定将SF、PVA和PVP与热响应性CS/β-GP水凝胶结合是否能提供更广泛的理化特性，从而筛选出一种适合脑内植入的配方。

在本研究中，我们探讨了掺入SF、PVA和PVP是否能系统地调节热响应性CS/β-GP水凝胶的理化特性和生物学特性，以用于卒中后脑修复。我们假设，将这些互补的天然和合成聚合物结合将能够在保持热响应可注射性和细胞相容性的同时，调节凝胶化行为、粘弹性特性、微结构和降解特性。为验证这一假设，我们首先开发并表征了一系列复合水凝胶配方，并基于与脑内递送相关的特性确定了优化配方。随后，我们在光血栓性卒中小鼠模型中评估了选定配方，以确定水凝胶组成是否影响卒中后组织微环境，特别是梗死灶演变、反应性星形胶质细胞增生、微胶质细胞活化和内源性神经母细胞反应。最后，由于水凝胶本身调节卒中后微环境可能不足以驱动持续的功能恢复，我们探讨了优化水凝胶是否能作为脑源性神经营养因子（BDNF）的局部递送平台，BDNF是已知促进卒中后神经可塑性的关键神经营养因子，以促进长期功能恢复[15]。

## 材料与方法

### 材料

CS（分子量：503 kDa，脱乙酰度：91%）购自中国上海瓦塞塔国际贸易有限公司。CS的分子量和脱乙酰度分别采用凝胶渗透色谱法（Agilent PL-GPC 50）和傅里叶变换红外光谱法表征[34]。PVA粉末（水解度：99%水解，分子量：89–98 kDa）和PVP粉末（分子量：360 kDa）、β-甘油磷酸二钠五水合物（分子量：306.11 Da）、来自鸡蛋清的新型酶……

### 水凝胶设计

用于脑修复的水凝胶必须可注射、在生理条件下快速凝胶化，并具有多孔结构以支持细胞浸润和分子转运[14]。为实现这些特性，我们设计了在室温（25°C）下保持液态，并在生理温度（37°C）下发生快速溶胶-凝胶转变的复合水凝胶，从而实现微创递送并在梗死腔内留存。基于我们先前优化的……

## 讨论

在本研究中，我们开发了一种由CS、β-GP、SF、PVA和PVP组成的热响应性复合水凝胶，并评估了其调节卒中后微环境和促进功能恢复的潜力。通过结合天然和合成聚合物，我们证明可以通过系统地调节聚合物组成来控制可注射性、凝胶化动力学、粘弹性特性和生物学功能，这些是脑修复生物材料的关键参数。

## 结论

生物高分子水凝胶代表了调节卒中后微环境和实现再生治疗局部递送的有前景策略。在本研究中，我们开发了一种由CS、SF、PVA、PVP和β-GP组成的热响应性复合水凝胶，用于卒中后脑修复。优化的F6水凝胶表现出良好的理化特性、体外生物可降解性和细胞相容性，同时减轻了反应性星形胶质细胞增生和微胶质细胞活化，并……

## CRediT作者贡献声明

Mozammel H. Bhuiyan：撰写 – 初稿、可视化、验证、方法学、调查研究、资金获取、形式化分析、数据管理、概念构思。
Emma K. Gowing：调查研究、形式化分析。
Ute Zellhuber-McMillan：调查研究、形式化分析。
Simon F.R. Hinkley：撰写 – 审阅与编辑。
M. Azam Ali：撰写 – 审阅与编辑、可视化、监督、资源、资金获取、概念构思。
Andrew N. Clarkson：撰写 – 审阅与编辑。

## 作者声明

所有符合作者资格标准的人员均列为作者，所有作者确认他们已充分参与工作以对其内容承担公共责任，包括参与概念、设计、分析、撰写或修改稿件。此外，每位作者确认该材料或类似材料在此文章发表于《Biomaterials Advances》之前未曾、也不会被提交至或发表于任何其他出版物。

## 资金支持信息

本项目由奥塔哥大学博士奖学金和新西兰商业、创新与就业部的资金支持。

## 利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本论文所述工作。

## 致谢

所有对本文所述工作做出实质性贡献（例如，技术帮助、撰写和编辑协助、一般性支持）但不符合作者资格标准的人员，均在致谢中列出，并已获得他们的许可。如果我们未包含致谢部分，则表示我们未收到非作者的实质性贡献。

Mozammel H. Bhuiyan | Emma K. Gowing | Ute Zellhuber-McMillan | Simon F.R. Hinkley | M. Azam Ali | Andrew N. Clarkson