基于苯并咪唑的FLAP抑制剂的结构扩展：鉴定靶向白三烯生物合成和癌细胞增殖的双作用制剂

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Structural expansion of benzimidazole-based FLAP inhibitors: identification of dual-action agents targeting leukotriene biosynthesis and Cancer cell proliferation

　　

•新型苯并咪唑酰胺类化合物是强效FLAP抑制剂。
•在C5和C2位进行系统SAR研究，获得了亚微摩尔级的FLAP抑制活性。
•化合物19以IC50为0.09 μM的效力强力抑制5-LO产物。
•部分衍生物对肿瘤细胞表现出抗增殖潜力。
•化合物16脱颖而出，成为一种靶向FLAP和肿瘤存活的双功能药物。

**引言**

炎症性疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、类风湿关节炎、过敏、动脉粥样硬化和癌症，均受到来自花生四烯酸（AA）代谢的脂质介质的强烈影响。1, 2 其中，白三烯（LTs）在放大和维持炎症反应中发挥核心作用。3 白三烯的生成始于胞质磷脂酶A2介导的AA释放，随后通过5-脂氧合酶（5-LO）途径转化为白三烯A4（LTA4），LTA4作为分支中间体，经LTA4水解酶生成白三烯B4（LTB4），或经LTC4合酶生成半胱氨酰白三烯（LTC4、LTD4、LTE4）。4 LTB4通过BLT受体促进白细胞募集，而半胱氨酰白三烯则激活CysLT受体，引起支气管收缩、黏液分泌增加和血管通透性增高（图1）。除了这些经典炎症作用外，LTB4还通过NF-κB和STAT3激活促存活信号通路，这些通路在多种肿瘤类型中驱动增殖、抗凋亡和转移行为。5

高效的白三烯生成依赖于5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP），这是一种整合核膜蛋白，负责将AA递送至5-LO，6, 7 使FLAP成为速率限制步骤，因此成为合理的干预靶点（图1）。8 靶向FLAP可能比直接抑制5-LO更具优势，因为FLAP抑制剂如MK-886在抑制白三烯生成的同时，保留了促炎症消退脂质介质（消退素、maresins、保护素）的生物合成，这些介质可促进炎症消退和组织修复。9, 10

早期针对白三烯通路的药物发现主要集中在过敏和哮喘领域，然而数十年的研究仅产生了少数上市药物。这些药物包括直接的5-LO抑制剂齐留通，其临床使用因不良的药代动力学特性和需要常规肝功能监测的肝毒性风险而受到限制。11, 12 另一种选择是CysLT1受体拮抗剂，如孟鲁司特和扎夫鲁司特，它们具有良好的疗效、安全性和方便的每日一次给药方案。然而，其作用机制高度受限，仅阻断CysLT1受体处的LTD4，而LTB4和其余半胱氨酰白三烯未被拮抗。13, 14 为克服这些局限性，FLAP抑制剂被开发出来，以实现对白三烯级联反应的更全面阻断。多个候选药物，包括MK-886、MK-591、BAY-X-1005、ABT-080、BI-665915和GSK2190915，已在哮喘和COPD的多个临床前和临床阶段进行评估。8, 15 其中，MK-591和BAY-X-1005在II期试验中显示出疗效。16, 17 特别值得注意的是，GSK2190915作为最成熟的候选药物，已证明可有效对抗过敏原诱导的哮喘反应，且具有良好的安全性特征。18

该通路的意义远不止于呼吸系统疾病，因为5-LO和FLAP在人体动脉粥样硬化病变中均表达上调，且与斑块不稳定性相关，MK-886和BAY-X-1005的药理学FLAP阻断在apoE/LDLR缺陷小鼠模型中可减少病变体积和T细胞含量。19, 20 与此一致，BAY-X-1005（DG-031/veliflapon）在心肌梗死生物标志物的II期试验中通过了，但由于意外的制剂问题，III期招募被暂停。21 人类遗传学也支持相同的结论：在编码FLAP的基因ALOX5AP中已编目了超过20,000个单核苷酸多态性，其中66个已被考察其与疾病的关系，变异体最一致地与冠状动脉疾病、心肌梗死和缺血性卒中相关。22 尽管这些关联在不同人群中不一致且未能通过荟萃分析解决，但它们仍将FLAP置于一个有遗传学支持的疾病轴中，而非纯粹的药理学问题。

FLAP最近还被认为是一个肿瘤学靶点，其中5-LO通路被认为是致癌过程中一个广泛失调的节点。23, 24 首先，FLAP的丰度本身对肿瘤细胞存活具有限制作用。在人类MDA-MB-231乳腺癌细胞中，选择性地下调FLAP（不改变5-LO表达），降低了5-HETE并减少了存活率，而FLAP过表达完全挽救了这一表型。25 而在肝细胞癌中，FLAP在几乎所有切除组织中过表达，与CYLD抑制、CD34+新生血管化和高Ki-67相关，并将中位术后生存期从104个月缩短至47个月。5 其次，FLAP抑制在多种肿瘤类型中均具有药理学效果。例如，MK-886抑制胰腺癌细胞增殖并在仓鼠模型中抑制致癌作用，在该疾病中5-LO和LTB4受体从早期PanIN病变开始即上调。26 而效力更强的第二代抑制剂MK-591（quiflapon）可在雄激素敏感和雄激素非依赖细胞中诱导凋亡，并与PI3-激酶抑制剂LY294002产生协同作用，表明白三烯生物合成阻断可与存活通路抑制合理联合使用。27 此外，MK-591被证明可通过诱导凋亡显著杀死前列腺癌干细胞（PCSC），表明5-LO/FLAP通路在PCSC存活中发挥重要作用。28 在套细胞淋巴瘤（MCL）中，其5-LO水平与中性粒细胞相当，GSK2190915（fiboflapon）在亚微摩尔浓度下减少迁移，并抑制对基质细胞的黏附，效果与Bruton酪氨酸激酶抑制剂伊布替尼相当，这指向其在迁移和基质参与中的作用，而不仅仅是增殖。29 第三，这种活性的一部分在机制上不同于白三烯阻断。在前列腺癌中，5-LO/FLAP抑制触发的凋亡通过下调蛋白激酶C-epsilon进行，确定了该通路下游一个明确的效应臂，而非非特异性细胞毒效应。30, 31 此外，MK-886的凋亡反应在缺乏5-LO的细胞中得以保留，提示FLAP本身参与细胞存活调控。

迄今为止，已报道了多种结构类型，如先前综述中所总结的，8 但只有少数FLAP抑制剂进入了临床测试（表1）。32, 33 尽管付出了广泛努力，但至今尚无FLAP抑制剂上市。MK-591、BAY-X-1005、ABT-080和GSK2190915等有前景候选药物的临床开发最终因不良药代动力学特征、意外的制剂挑战和皮肤皮疹等不良反应等多种因素而停止。此外，无法证明其相对于标准疗法的显著临床优势，加上在竞争激烈的呼吸疾病领域的战略优先级转移，促成了它们的终止。8, 15, 34 最新的候选药物AZD5718（atuliflapon）在I期试验中耐受性良好，且将白三烯生成抑制了超过90%，因此进入了蛋白尿性慢性肾脏病的II期试验，并在冠状动脉疾病中进行独立评估。35, 36 这些II期试验在心血管和肾脏方面给出了混合结果，未达到主要疗效终点。阿斯利康随后将atuliflapon从积极开发中移出，纳入其开放式创新计划，其作为临床阶段分子仍可对外部研究者进行独立研究。值得注意的是，上述肿瘤学证据几乎完全基于第一代和第二代工具化合物，尚无FLAP抑制剂在注册临床试验中得到评估。因此，仍存在对新型药物样FLAP调节剂的迫切未满足需求，这些调节剂应兼具高抑制效力以及优化的结构、理化性质和安全性特征。

出于对新型花生四烯酸通路调节剂持续需求的驱动，我们致力于开发能够中断靶向PGE2和/或白三烯生物合成这些通路的新型化合物。37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 在此背景下，我们此前鉴定了一种苯并咪唑类化合物（BRP-7，图2），该化合物含有类似于布洛芬的结构特征。37, 43 该分子在完整中性粒细胞中表现出对5-LO衍生产物生成的显著抑制（IC50 = 0.31 μM），并被确定为直接的FLAP抑制剂。43 最近，为开发基于BRP-7骨架的双功能可溶性环氧水解酶（sEH）/FLAP抑制剂，我们报道了一系列苄胺酰胺衍生物，包括FP1-FP8（图2）。45 尽管这些苯并咪唑核心的修饰对sEH抑制有利，但显著损害了FLAP抑制活性，IC50值约为2-5 μM。

在此基础上，本研究旨在系统重构BRP-7骨架，以期恢复并优化FLAP抑制活性，同时扩展苄胺酰胺区域的结构和理化多样性。为此，我们在苯并咪唑核心的C(5)位引入了一系列芳香族、饱和杂环和极性脂肪族酰胺取代基，以探索更广泛的化学空间。此外，C(2)位被多种含氟、构象受限和极化性生物电子等排体所多样化，以进一步探索FLAP抑制的结构要求。这种双位点修饰策略使得可以系统探索围绕苯并咪唑核心及其外围的化学空间，从而获得比此前更广泛的BRP-7构效关系（SAR）。

该结构类型与表1中总结的FLAP抑制剂有几个显著区别。在化学方面，临床和临床前基准药物主要由含疏水性喹啉甲氧基或叔丁基硫取代基的吲哚类羧酸主导（MK-886、quiflapon、fiboflapon），以及较新的含噁二唑和氨基吡唑的酰胺类化合物（BI-665915、atuliflapon）；本文所探索的1-苄基-2-(1-芳基乙基)苯并咪唑-5-甲酰胺骨架在结构上与两者均不同，且不需要酸性头基或喹啉锚定点即可实现细胞活性。此外，在合成方面，所有最终化合物均通过单一的高级羧酸中间体（4, 42-52或67）汇聚式合成，并在最后一步通过酰胺偶联组装，这使多样化点置于序列末端，便于迭代式SAR扩展和并行文库合成。在药理学方面，最活性的类似物无需酸性功能即可在完整人白细胞中以低于100 nM的浓度抑制FLAP依赖的5-LO产物生成，且下文描述的脂质介质谱分析表明，该抑制特异性地局限于5-LO/FLAP分支，而COX和12/15-LO衍生的介质以及在M1-MDM中特异性促消退介质的生物合成基本不受影响。

除了FLAP抑制外，我们还考察了该结构类型的更广泛治疗范围。鉴于炎症信号与肿瘤进展之间的相互作用已有充分文献记载，且受到近期专利披露的启发——这些专利将抗癌活性归因于结构相关的苯并咪唑类和吲哚类抑制剂如MK-886，46 所有新合成的衍生物均并行评估了抗增殖效应。这种双轨评估旨在鉴定能够同时调节白三烯生物合成和肿瘤细胞增殖的结构优化化合物，并阐明控制每种活性的结构特征。

当代药物化学日益依赖于计算和人工智能（AI）辅助的整个发现周期的工作流程，FLAP导向设计也不例外。机器学习模型现在有助于靶点评估、先导化合物鉴定和先导优化，深度学习方法将这一领域从合成库扩展到天然产物化学空间，帮助优先选择仅凭药物化学直觉难以选择的骨架。47 最有成效的应用是将计算与实验相结合：基于对接和建模的优化已被用于将可逆抑制剂转化为靶向蛋白降解剂，48, 49 设计对两种机制无关的酶具有平衡活性的双靶点药物，50 以及工程化具有时空可控药理活性的光激活配体。49 两项发展与本工作尤为相关。首先，共折叠深度学习模型可直接从序列和配体结构预测蛋白-配体复合物，从而为嵌入膜内的靶点如FLAP生成结构假设，而这些新结构类型的实验共结构仍然稀缺。其次，基于物理的分子描述符计算和机器学习ADMET分类器允许在资源密集的合成和体内剖析之前标记理化、代谢和安全性风险，这对于本类疏水性结构类型至关重要。因此，我们将本文报告的实验SAR与基于深度学习的蛋白-配体复合物预测以及体外理化、ADME和药代动力学剖析相结合，将两者视为定义下一轮设计的假设生成工具，而非实验验证的替代品。

**化学部分概要**

在苯并咪唑环5位带有酰胺取代基的最终化合物，其中5-10为芳香族，11-23为脂肪族，均从关键中间体4获得，该中间体按照我们先前报道的方法制备，45 并完整描述于支持信息中（图S3）。在最后一步，5-羧基-BRP7（4）在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）和4-二甲基氨基吡啶存在下与相应胺偶联。

**结论**

本研究在BRP-7苯并咪唑骨架的C(5)和C(2)位扩展了结构多样性，旨在恢复我们早期苄胺酰胺系列中丧失的FLAP效力。对可变区域的系统修饰表明，传统芳香族基团可以被极性、空间位阻的脂肪族取代基替换而不影响活性。1,1-二甲基乙醇类似物19以IC50为0.09 μM抑制细胞FLAP依赖的5-LO产物生成，并且……

**通用部分**

所有起始材料、试剂和溶剂均购自商业来源，未经进一步纯化直接使用。核磁共振（NMR）波谱（1H和13C）在DMSO-d6或CDCl3中，使用Varian Mercury 400 MHz、Bruker Avance III 400 MHz或Bruker Avance Neo 500 MHz波谱仪记录，以四甲基硅烷（TMS）作为内标。

化学位移以 δ（ppm）表示，偶合常数（J）以 Hz 表示。高分辨率质谱（HRMS）在 Waters LCT 上记录。CRediT 作者贡献声明：Mehmet Karata?：方法论、调查研究、正式分析。Hannes Engelbrecht：方法论、调查研究、正式分析。Paul M. Jordan：写作——审阅与编辑、监督、方法论、数据整理。?zge Akbulut ?al??kan：调查研究、正式分析。Kübra ?al??kan：写作——初稿撰写、项目管理、方法论、数据整理、概念构思。Burcu ?al??kan：写作——审阅与编辑、监督、方法论、概念构思。Oliver Werz：写作——审阅与编辑。知情同意与患者信息：已获取所有参与者或其法定代理人同意参与本研究并发布论文的书面知情同意书。已遵守参与者的隐私权利。人类及生物材料：本研究包含器官或组织捐赠者。本研究涉及人类生物材料，已获取捐赠者或其近亲属或法定代理人同意用于本研究及论文发表。本研究使用的样品未来源于已处决者。利益冲突声明：作者声明以下财务利益/人际关系可能被视为潜在利益冲突：Erden Banoglu 报告获得 Gazi 大学的财务支持。Oliver Werz 报告获得德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的财务支持。其他作者声明，不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或人际关系。致谢：本研究部分由 Gazi 大学科学研究项目单位（项目编号：TUI-2023-8501）资助，并由德国研究基金会（DFG）SFB 1278"PolyTarget"（项目编号 316213987，项目 A04）和 SFB 1127"ChemBioSys"（项目编号 239748522，项目 A04）资助。BI-665915 由 Berlin-Ingelheim 通过其开放创新平台 opnMe 慷慨提供，网址为 https://www.opnme.com。Mehmet Karata?|Hannes Engelbrecht|Paul M. Jordan|?zge Akbulut ?al??kan|Kübra ?al??kan|Burcu ?al??kan|Oliver Werz|Erden Banoglu