伊塔康酸（Iaconate）作为一种内源性抑制剂，能够抑制促炎巨噬细胞的激活，从而减轻肝脏纤维化过程中的炎症反应

《Hepatology Communications》：Itaconate as the endogenous brake of proinflammatory macrophage activation alleviates inflammation in liver fibrogenesis

　　**背景：**肝脏炎症和纤维化是对慢性肝损伤的修复反应。骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞（BMDMs）是其中的关键参与者。我们之前的研究表明，Sphingosine-1-phosphate（S1P）可以激活BMDMs，使其呈现促炎表型。Aconitate脱羧酶1（ACOD1）/itaconate是一种抗炎分子。然而，目前尚不清楚ACOD1/itaconate是否参与了S1P诱导的BMDM激活过程。

**方法：**我们使用蛋氨酸-胆碱缺乏和高脂肪饮食来诱导小鼠的肝损伤和纤维化。为了阐明内源性ACOD1/itaconate在肝纤维化中的角色，我们建立了两种嵌合小鼠模型：（1）骨髓（BM）Acod1缺乏（将WT或Acod1敲除的BM移植到野生型小鼠中）；（2）仅BM表达Acod1（将WT或Acod1敲除的BM移植到Acod1敲除的小鼠中）。

**结果：**单细胞RNA测序数据显示，Acod1在受损的BMDMs中高度表达。Acod1+ BMDMs表现出促炎表型，其促炎基因的表达水平升高。体外实验中，S1P处理的BMDMs中ACOD1的表达和itaconate的产生均被上调。BMDMs中的内源性ACOD1/itaconate通过与NF-κB信号通路的负反馈作用抑制了BMDMs的促炎激活。S1P通过相同的信号通路（S1PR2/MAPK/NF-κB信号通路）调节ACOD1的表达和BMDM的激活，这说明ACOD1/itaconate具有内源性制动功能。在骨髓Acod1缺乏的嵌合小鼠中，去除ACOD1/itaconate的内源性制动功能会加重肝炎症和纤维化。而仅BM表达Acod1的小鼠则表现出相反的效果。

**结论：**ACOD1/itaconate在慢性肝损伤期间对BMDMs的促炎激活具有内源性制动作用。我们的数据证明了ACOD1/itaconate在S1P诱导的BMDM激活中的作用，进一步表明ACOD1/itaconate可能是治疗肝炎症和纤维化的潜在策略。

**引言：**肝纤维化是一种常见的病理过程，其特征是细胞外基质的过度沉积，是对各种病因（如脂肪肝损伤）引起的慢性肝损伤的修复反应。在肝纤维化过程中，肝脏炎症是一个必要步骤，与纤维化的启动和发展密切相关。作为肝脏免疫系统的重要组成部分，巨噬细胞在肝炎症和纤维化中起着关键作用。在正常肝脏中，肝脏巨噬细胞主要由常住的库普弗细胞（KCs）组成。然而，在肝损伤期间，许多骨髓（BM）来源的单核细胞/巨噬细胞（BMDMs）被招募到受损的肝脏中。这些BMDMs被促炎介质（如Sphingosine-1-phosphate（S1P）激活后，会分泌多种炎症细胞因子和趋化因子，从而放大炎症反应。因此，促炎巨噬细胞已被认为是治疗肝纤维化的潜在靶点。鉴于目前缺乏针对肝纤维化的特异性和有效疗法，进一步研究调节巨噬细胞促炎激活的因素是必要的。

**S1P**是一种生物活性脂质，已被报道是肝炎症和纤维化的重要诱导因素。S1P通过与特定G蛋白偶联受体（即S1PR1-S1PR5）结合来调节细胞反应。先前的研究表明，S1P/S1PRs在BMDMs的促炎激活中起重要作用。我们的先前研究报道，S1P/S1PR2通过Gα(12/13)/MAPK信号通路促进促炎基因（NLRP3、IL-1β和IL-18）的表达，并介导胆汁淤积性肝损伤中的NLRP3炎性体激活。更重要的是，选择性阻断巨噬细胞的S1PR2可显著减轻肝炎症和纤维化。然而，仍需深入研究S1P/S1PRs调节巨噬细胞促炎激活的详细机制，以便通过抑制巨噬细胞激活来寻找潜在的抗纤维化疗法。

**Aconitate脱羧酶1（ACOD1）**，也称为免疫响应基因1（IRG1），编码一种催化itaconate生成的关键酶。据报道，ACOD1/itaconate在免疫细胞中具有抗炎作用。在巨噬细胞中，ACOD1被促炎介质（如脂多糖和INF-γ）上调，从而增加itaconate的产生。在脂多糖或INF-γ激活的巨噬细胞中，itaconate通过多种方式抑制炎症细胞因子的产生，例如抑制琥珀酸脱氢酶、抑制IRAK4导致NF-κB降解以及激活Nrf2以抑制促炎基因的转录。由于其免疫调节作用，ACOD1/itaconate在治疗肝疾病方面显示出显著潜力。我们最近的研究还表明，Acod1缺乏会促进肝炎症，这说明ACOD1/itaconate在慢性肝疾病中具有保护作用。然而，目前尚不清楚ACOD1/itaconate是否参与了S1P诱导的肝损伤中BMDMs的促炎激活过程。

**在本研究中，我们重点研究了ACOD1/itaconate在肝炎症和纤维化期间BMDM激活中的作用。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据显示，Acod1在受损的BMDMs中高度表达。进一步分析表明，Acod1+ BMDMs表现出促炎表型，其促炎基因的表达水平升高。体外实验中，S1P处理的BMDMs中ACOD1的表达和itaconate的产生均被上调。BMDMs中的内源性ACOD1/itaconate通过抑制NF-κB信号通路抑制了BMDMs的促炎激活。此外，S1P通过S1PR2/MAPK/NF-κB信号通路调节ACOD1的表达，这也参与了BMDMs的促炎激活，表明ACOD1/itaconate在S1P诱导的BMDM激活中具有内源性制动功能。在骨髓Acod1缺乏的嵌合小鼠中，去除ACOD1/itaconate的内源性制动功能会加重肝炎症和纤维化。仅BM表达Acod1的小鼠则表现出相反的效果。我们的数据证明了ACOD1/itaconate在S1P诱导的BMDM促炎激活中的作用及其潜在机制，进一步表明ACOD1/itaconate是治疗肝炎症和纤维化的潜在策略。**

**材料与方法：**
- **小鼠模型：**使用ICR或C57BL/6 N雄性小鼠（6-8周龄，每组6只）作为慢性肝损伤模型。通过喂食含45%脂肪、0.1%蛋氨酸且不含胆碱的5克/天对照饮食（CD）或蛋氨酸-胆碱缺乏和高脂肪饮食（MCDHFD，A06071309，Research Diet Inc.）来诱导慢性肝损伤。
- **嵌合小鼠构建：**将野生型（WT）和Acod1敲除（KO）小鼠（C57BL/6 N，6-8周龄，雄性，每组不少于6只）进行致死剂量辐射（8 Gy）处理8分钟后，立即通过尾静脉移植1×10^7个WT或KO BM细胞。四周后，继续喂食MCDHFD饮食2周。所有小鼠均置于特定病原体免费、温度控制的环境中，遵循12小时光照/黑暗周期。在模型建立后的指定时间点对小鼠进行麻醉并采集血液和肝脏样本。所有动物实验均符合首都医科大学伦理委员会的规定（批准编号：AEEI-2022-212）。

- **原代BMDM培养：**对6-8周龄的C57BL/6 N小鼠进行麻醉并通过颈椎脱位处死。使用25 G针头从骨髓腔中取出BM细胞，并用70 μm细胞滤网过滤。以1200 rpm离心5分钟后，重新悬浮细胞 pellet，并在含有10% FBS、1%青霉素-链霉素和10% L929细胞条件培养基的RPMI-1640培养基中分化7天。

**scRNA-seq数据分析：**使用Loupe Browser 7（10× Genomics，美国Pleasanton）分析Acod1的表达以及Acod1+ BMDMs中差异表达的基因。通过Metascape进行GO和KEGG分析。

- **HPLC分析：**为了测量巨噬细胞中的itaconate含量，在指定处理后向细胞中加入冰镇的80%甲醇。在冰浴中超声处理后，完全破坏细胞。随后以13,000 rpm离心10分钟以去除蛋白质。收集上清液并用Termovap Sample Concentrator干燥。然后加入0.05%磷酸水溶液：乙腈（95:5）以重新溶解可溶性物质（包括itaconate），避免溶剂的影响。涡旋后再次离心10分钟以去除不溶性物质。所有样本均在Agilent 1260 HPLC系统（Agilent Technologies Inc.）上进行分离，使用X Select C18柱（3.0×150 mm，5 μm）和多波长UV检测器进行检测。

**统计分析：**数据以平均值± SEM表示。首先分析数据集的正态性。对于符合正态分布的数据，使用ANOVA和Student t检验进行分析；对于不符合正态分布的数据，使用非参数统计方法。p<0.05视为显著。所有结果均通过至少3次独立实验验证。

**补充材料：**更多材料和方法请参见补充资料：https://links.lww.com/HC9/C455。

**结果：**
- **慢性肝损伤期间Acod1的表达增加与BMDMs中炎症基因表达增强相关：**首先，我们通过分析之前的scRNA-seq数据研究了慢性肝损伤小鼠中Acod1的表达模式。从喂食CD或MCDHFD 14天的小鼠肝脏中分离出肝非实质细胞，并进行scRNA-seq（图1A）。结果表明，Acod1在肝非实质细胞中的单核细胞和巨噬细胞（MoM）簇中高度表达（图1B和C）。此外，受损MoMs中的Acod1表达显著增加（图1C）。根据这一结果，计算得出约78.7%的Acod1+ MoMs为受损细胞（图1D，左侧）。还分析了MoM群体中Acod1+细胞的百分比，结果显示在肝损伤期间，Acod1+ MoMs的百分比从约1.5%（CD）增加到约15.7%（MCDHFD）（图1D，右侧）。

**图1：**
- scRNA-seq显示，在慢性肝损伤期间，Acod1的表达增加与BMDMs中炎症基因表达增强相关。（A）从喂食CD或MCDHFD的小鼠肝脏中分离出肝非实质细胞并进行scRNA-seq。（B）细胞簇的t-SNE图。（C）非实质细胞中Acod1的表达。（D）MoM群体中Acod1+细胞的百分比。（E）MoMs的重聚分析。将细胞分为KCs、BMDMs和单核细胞（左侧），并分析这些细胞中Acod1的表达（中间），同时研究Acod1+ MoMs的百分比（右侧）。（F）Acod1+或Acod1? BMDMs中代表性促炎基因的表达。（G）Acod1+ BMDMs中高表达基因的GO分析。（H）处理或未处理MCDHFD的小鼠肝脏组织中Acod1与促炎基因的相关性分析（n=60）。缩写说明：ACOD1，aconitate脱羧酶1；BMDMs，骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞；CD，对照饮食；MCDHFD，蛋氨酸-胆碱缺乏和高脂肪饮食；MoM，单核细胞和巨噬细胞；NPC，非实质细胞；scRNA-seq，单细胞RNA测序。
- **进一步分析：**我们选择了MoMs进行进一步分析。将MoMs重新聚类并与3个亚群（KCs、BMDMs和单核细胞）分开（图1E，左侧）。t-SNE和violin图显示Acod1在BMDM簇中特异性表达（图1E，中间）。计算得出约73.4%的Acod1+ MoMs为BMDMs，而KCs和单核细胞的百分比分别为约10.7%和16%（图1E，右侧）。进一步深入分析了BMDMs中的Acod1表达，结果显示Acod1在受损BMDMs中高度表达，且约96.8%的Acod1+ BMDMs来自MCDHFD喂养的小鼠（图1E，下方）。正常BMDMs中的Acod1表达非常低（图1E，下方）。这些结果表明，在慢性肝损伤期间，Acod1在MoMs尤其是BMDMs中显著增加。
- **关注Acod1+ BMDMs的特征：**我们分析了Acod1+ BMDMs中差异表达的基因（与Acod1? BMDMs相比，p<0.05），并对在Acod1+ BMDMs中高表达的基因进行了GO分析。有趣的是，我们发现Acod1+ BMDMs参与了炎症过程，如“免疫反应的激活”、“先天免疫反应的正向调节”、“炎症反应”和“白细胞激活”（图1G）。Violin图显示Acod1+ BMDMs高度表达多种促炎基因，包括Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Tnf（图1F）。此外，我们还研究了肝损伤过程中Acod1表达与促炎基因表达之间的相关性，发现Acod1的mRNA表达与这些基因的表达呈正相关（图1H）。这些结果表明，ACOD1表达的增加与BMDMs中炎症基因表达的增加同时发生。

- **S1P激活的促炎BMDMs中ACOD1表达和itaconate产生上调：**随后我们分离出原代BMDMs，以探讨ACOD1与BMDMs促炎激活之间的关系。我们使用S1P处理BMDMs，因为S1P已被报道是强大的BMDMs促炎激活诱导因子。RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续上升（图2A，左侧）。我们还在不同时间段内检测了用S1P处理的BMDMs（骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞）中Acod1的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时内显著增加，然后保持在这一较高水平直到12小时（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B，C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。随后我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯产量，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD（甲硫氨酸-胆碱缺乏和高脂肪饮食）喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中，异麦酸酯的水平也有所升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达也因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs中的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步说明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR的结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还在不同时间点检测了用S1P处理的BMDMs中Acod1的表达。结果发现，从2小时到4小时Acod1的表达显著增加，之后保持在这个较高的水平直到12小时（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。接着我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中异麦酸酯的产量，结果显示S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中，异麦酸酯的水平也有所升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了在不同时间段内用S1P处理的BMDMs中Acod1的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，随后保持在这个较高水平直到12小时（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。随后我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中异麦酸酯的产量，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中，异麦酸酯的水平也有所升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果表明，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续上升（图2A，左侧）。我们还检测了在不同时间段内用S1P处理的BMDMs中Acod1的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，然后保持在这个较高水平直到12小时（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。随后我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中异麦酸酯的产量，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中，异麦酸酯的水平也有所升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR的结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的Acod1表达情况。发现Acod1的表达从2小时到4小时显著增加，然后在12小时时稳定在这个水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的表达情况。发现Acod1的表达从2小时到4小时显著增加，然后在12小时时达到稳定水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，然后在12小时时达到稳定水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，然后在12小时时达到稳定水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，然后在12小时时达到稳定水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，然后在12小时时达到稳定水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，然后在12小时时达到稳定水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因（Nlrp3、Il1b、Il18、Ccl2和Ccl4）的表达因S1P处理而上调，并且与Acod1的表达呈正相关（图2G）。这些数据表明，S1P在体外通过诱导BMDMs的促炎反应同时提高了ACOD1的表达和异麦酸酯的生成，进一步证明了ACOD1/异麦酸酯与BMDMs促炎反应之间的密切关联。

RT-qPCR结果显示，随着S1P浓度的增加，Acod1的mRNA表达持续增加（图2A，左侧）。我们还检测了用S1P处理的BMDMs在不同时间点的表达情况。发现Acod1的表达在2到4小时显著增加，然后在12小时时达到稳定水平（图2A，右侧）。与这些发现一致，S1P以时间和浓度依赖的方式上调了ACOD1的蛋白质水平（图2B、C，补充图S3A，https://links.lww.com/HC9/C455）。我们使用HPLC检测了S1P处理的BMDMs中的异麦酸酯生成情况，发现S1P也以剂量依赖的方式促进了异麦酸酯的生成（图2D，左侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。从MCDHFD喂养的小鼠中分离出的肝巨噬细胞中的异麦酸酯水平也升高（图2D，右侧，以及补充图S2，https://links.lww.com/HC9/C455）。此外，在BMDMs中，促炎基因缩写：BM，骨髓；KO，敲除；MCDHFD，甲硫氨酸-胆碱缺乏和高脂饮食；WT，野生型。

**讨论**
在本次研究中，我们证明了ACOD1/苹果酸在慢性肝损伤期间对BMDMs（骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞）的促炎激活具有内在的抑制作用。在纤维化肝脏中，ACOD1在肝巨噬细胞（尤其是BMDMs）中高表达，而在正常BMDMs中的表达量非常低。此外，ACOD1+ BMDMs表现出更强的促炎特性。体外实验表明，介导BMDMs促炎激活的S1P/S1PR2/MAPK/NF-κB信号通路也会提高BMDMs中的ACOD1表达和苹果酸的产生。进一步的研究表明，BMDMs中的内源性ACOD1/苹果酸与NF-κB信号通路形成负反馈循环，从而抑制BMDMs的促炎反应。此外，BM中Acod1的缺乏会加剧肝脏炎症和纤维化，而单独表达BM中的Acod1可以缓解这些效应（见图7）。

**图7**
示意图展示了ACOD1/苹果酸作为慢性肝损伤中抑制巨噬细胞促炎激活的内在负反馈机制。缩写：ACOD1，苹果酸脱羧酶1；BMDMs，骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞；KO，敲除；S1P，鞘氨醇-1-磷酸；WT，野生型。

S1P/S1PRs已被报道为巨噬细胞功能的重要介质。在代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎中，髓系细胞中S1PR1的缺失减少了炎症性巨噬细胞并减轻了代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎。17 在急性肺损伤中，核S1P通过促进巨噬细胞中p53的乙酰化来诱导氧化应激和NLRP3炎症小体的激活。18 S1P/S1PR1还促进狼疮性肾炎中的巨噬细胞促炎反应和NLRP3炎症小体的激活。19 在小胶质细胞中，S1P作为TREM2配体，促进吞噬作用并保护脑免受缺血损伤，20 而在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，S1P则抑制肿瘤细胞的吞噬。21 我们之前的研究已经证明了S1P/S1PRs在肝脏炎症和纤维化中的作用。在胆汁淤积性肝损伤中，S1P通过S1PR2和S1PR3诱导BMDMs向受损肝脏迁移。22 抑制S1PR2/3介导的BMDMs迁移显著减轻了肝脏炎症和纤维化。22,23 进一步的研究表明，S1P和S1PR2/3通过HuR/miR-455-5p/IQGAP1轴调节BMDMs的迁移。24 在脂肪肝损伤中，S1P通过miRNA-1249-5p上调MCP-1的表达。24 此外，S1P通过S1PR2/MAPK信号通路促进巨噬细胞的促炎激活。10 S1PR2还通过与GDCA结合促进ZBP1/p-MLKL轴介导的巨噬细胞凋亡。25 因此，选择性抑制巨噬细胞中的S1PR2具有显著的抗炎和抗纤维化作用。

在本研究中，我们报告了S1P调节BMDMs促炎激活的新机制。S1P通过S1PR2/MAPK/NF-κB信号通路上调BMDMs中的ACOD1表达和苹果酸的产生。BMDMs中的内源性ACOD1/苹果酸对S1P诱导的BMDMs激活具有抗炎作用。尽管在炎症性巨噬细胞中广泛观察到ACOD1表达上调，但其调控机制尚未完全阐明。在结核分枝杆菌感染中，ACOD1的表达由两条吞噬依赖性信号通路诱导：TLR2/MyD88/NF-κB通路和STING/IFN-I/IFNAR通路。26 在斑马鱼感染模型中，C/EBP和JAK/STAT通路调节巨噬细胞中的ACOD1表达。27 此外，转录因子TFEB和IRF1也被报道可以调节巨噬细胞中的ACOD1表达。28,29 本研究证明NF-κB信号通路也参与S1P诱导的ACOD1表达，从而形成负反馈循环来调节BMDMs的促炎反应。此外，我们还发现了一条新的信号通路，即S1PR2/MAPK信号通路，该通路调节ACOD1表达。我们之前的研究已经表明S1PR2/MAPK信号通路也参与BMDMs的促炎激活。10 这些结果表明S1P通过相同的信号通路诱导ACOD1表达和BMDMs的激活，并且ACOD1通过与NF-κB的负反馈机制发挥其抗炎作用。ScRNA-seq数据显示，ACOD1的上调和促炎基因的表达增加发生在同一群BMDMs中，表明ACOD1/苹果酸是S1P诱导的BMDMs激活的内在抑制因子。

ACOD1/苹果酸最初是在受到促炎刺激的活化巨噬细胞中研究的，21 并被认为是一种重要的抗炎介质。ACOD1/苹果酸的抗炎机制已在脂多糖激活或IFN-γ激活的巨噬细胞中得到证实。例如，苹果酸通过抑制琥珀酸脱氢酶来减少促炎细胞因子的产生。30 KEAP1/Nrf2信号通路（防御氧化应激的关键因子）也被确定为ACOD1/苹果酸的作用靶点。31 通过调节KEAP1/Nrf2的激活，苹果酸及其衍生物（4-OI和二甲苹果酸）发挥抗炎作用。32–34 此外，苹果酸通过靶向IRAK4促进NF-κB的降解。35 据报道，苹果酸还可以与DNA双加氧酶TET-2结合，从而抑制TET-2的催化活性和巨噬细胞中的炎症反应。36 此外，苹果酸还可以调节关键促炎基因（如GSDMD和NLRP3）的烷基化，直接抑制巨噬细胞中的凋亡和炎症小体激活。37–39 本文首次报道ACOD1/苹果酸也参与肝脏损伤中S1P诱导的BMDMs的促炎反应。在纤维化肝脏中，BMDMs中的ACOD1水平显著升高。体外实验显示，S1P促进BMDMs中ACOD1的表达并产生苹果酸，这一过程依赖于S1PR2/MAPK/NF-κB通路。S1P诱导的BMDMs中的ACOD1表达和苹果酸产生有助于减轻肝脏炎症和纤维化。

越来越多的证据证实了ACOD1/苹果酸对慢性肝损伤的保护作用。在硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝纤维化中，ACOD1/苹果酸通过抑制HSC的铁死亡来缓解肝纤维化。40 通过调节NRF2通路，4-OI改善了CCl4和TAA诱导的小鼠肝纤维化模型中的肝脏损伤和纤维化。41,42 在原发性硬化性胆管炎中，苹果酸抑制组织驻留记忆T细胞的激活，从而减轻肝胆损伤。43 在MASLD中，Acod1的缺乏会加重高脂饮食引起的代谢紊乱，而4-OI可以逆转肝脏脂肪变性。44,45 最近的研究显示，中性粒细胞来源的ACOD1/苹果酸在慢性肝损伤中具有保护作用。在正常肝组织中，ACOD1主要在中性粒细胞中表达。在肝损伤期间，中性粒细胞中的ACOD1表达显著上调。机制上，中性粒细胞来源的苹果酸通过调节GSDMD的Cys192位点来抑制GSDMD的切割和中性粒细胞胞外陷阱的形成。14 本研究进一步探讨了巨噬细胞来源的ACOD1/苹果酸在肝脏炎症和纤维化中的作用。ScRNA-seq数据显示，正常肝组织中ACOD1+巨噬细胞的比例极低，而在损伤肝组织中显著增加，表明巨噬细胞来源的ACOD1/苹果酸在肝脏炎症和纤维化中起着重要作用。与以往的研究不同，我们的研究揭示了ACOD1/苹果酸参与肝脏纤维化的新机制。具体来说，内源性ACOD1/苹果酸作为一种内在分子制动因子，抑制S1P驱动的BMDMs促炎反应。总的来说，这些发现从多个角度进一步支持了ACOD1/苹果酸在慢性肝损伤中的强大抗炎和抗纤维化潜力，全面阐述了其在慢性肝病中的功能，并强调了ACOD1/苹果酸作为治疗肝炎症和纤维化的潜在策略的价值。