基因组和免疫分析表征了肝内胆管癌中的免疫异质性及一种TIGIT相关亚型

《Hepatology Communications》：Genomic and immune profiling characterizes immune heterogeneity and a TIGIT-associated subtype in intrahepatic cholangiocarcinoma

　　

背景
肝内胆管癌（iCCA）以显著的分子和微环境异质性及对免疫治疗的中等反应为特征。我们旨在界定 iCCA 中免疫检查点活性的基因组和空间决定因素，及其与临床预后的关联。

方法
我们对一组 144 例 iCCA 患者进行了整合转录组、DNA 面板测序和多重免疫组化分析。肿瘤根据 STIM 定义的微环境亚型进行分类。在肿瘤核心、间质、侵袭边缘和邻近肝脏中进行了空间分辨的免疫分析。使用 Cox 回归和 Kaplan-Meier 方法分析免疫检查点表达、细胞邻近性和临床预后。进一步通过差异基因表达和通路富集分析对 TIGIT 高表达肿瘤进行了表征。

结果
STIM 分类将肿瘤分为炎症型（47%）和非炎症型（53%）亚型，具有不同的生存结果和基因组特征。CDKN2A/B、TP53、MTAP 和 BAP1 的复发性改变显示出亚型特异性富集和预后相关性。空间免疫分析揭示 T 细胞和免疫检查点在特定区室的分布，TIGIT 和 PD-1 表达主要存在于间质和边缘区域。大多数肿瘤浸润 T 细胞缺乏抑制性受体表达，而多种检查点共表达并不常见。TIGIT 高表达肿瘤显示出免疫效应、抗原呈递和干扰素信号通路的协同激活，并伴随特定基因组改变的富集，从而定义了一个免疫激活的分子亚型。

结论
整合基因组和空间免疫分析揭示了 iCCA 中免疫检查点调节存在显著的依赖背景异质性。TIGIT 界定了一个具有独特分子特征的免疫激活亚型，为患者分层和理性免疫治疗靶向提供了潜在的生物标志物框架。

引言
肝内胆管癌（iCCA）是一种具有侵袭性和分子异质性的原发性肝癌，全球发病率呈上升趋势。过去十年，精准肿瘤学的进展开始重塑其治疗格局。靶向复发性基因组改变（GAs）的选择性抑制剂可在分子定义的亚组中诱导持久反应，免疫检查点抑制剂（ICIs）在胆道癌（BTC）患者中显示出持续但适度的临床活性。1 然而，大多数患者的总生存期（OS）获益仍然有限。进一步进展的主要障碍在于缺乏稳健、广泛验证的生物标志物（除可操作 GAs 外），以可靠地识别最可能从系统性治疗中受益的患者，特别是从 ICI 联合治疗中受益的患者。

大规模基因组和转录组分析已界定 iCCA 中影响生物学、预后和治疗机会的复发性分子特征。2 经典致癌驱动基因包括 FGFR2 基因融合以及 IDH1/2 和 BRAFV600E 突变等，这些定义了治疗利基。3–5 此外还观察到染色质修饰因子（如 BAP1, ARID1A）、抑癌基因（TP53, CDKN2A/B）以及参与 DNA 修复和基因组稳定性的基因改变，导致临床行为异质性。在通路水平上，聚合特征指向 RTK-RAS 信号、PI3K-AKT-mTOR 通路、WNT 信号和细胞周期调控网络频繁受扰。6 整合转录组分类器将肿瘤分为“炎症型”（免疫丰富）和“非炎症型”（免疫排斥或免疫荒漠）表型，更精细的方案捕捉了间质组成、巨噬细胞极化和 T 细胞耗竭特征，具有预后和潜在预测价值。7

与 ICI 敏感性相关的临床可操作特征在 iCCA 中相对少见。微卫星不稳定性（MSI）肿瘤和高肿瘤突变负荷（TMBhigh）肿瘤——这两种均为跨癌种 ICI 响应生物标志物——在 iCCA 中罕见。2 同样，其他产生大量新抗原的基因组过程缺陷发生频率低，限制了预计能引发强力新抗原驱动抗肿瘤免疫反应的患者比例。通过免疫组化评估的 PD-L1 表达已作为 BTC 的潜在预测标志物被探索，但其效用不一致：iCCA 中 PD-L1 常表现为低或异质性表达，且 PD-L1 阳性不能预测该疾病对 PD-1/PD-L1 阻断的反应。8–10 因此，仅凭 PD-L1 状态不足以进行患者选择，且在 MSI/TMBhigh 亚组之外 ICI 响应率仍有限。

最近的空间和单细胞研究强调了额外的复杂性：免疫检查点（IC）分子（如 PD-1, TIGIT, LAG-3 和 CTLA-4）在肿瘤内分布异质，并可在肿瘤核心、间质或侵袭边缘中差异富集。耗竭或调节性淋巴细胞与癌细胞的共表达模式及物理邻近性可能进一步调节治疗反应。这些空间维度无法通过宏基因组测序捕捉，并可能解释临床上观察到的生物标志物 - 反应关系不一致。

鉴于经典 ICI 生物标志物在 iCCA 中 prevalence 有限，迫切需要整合生物标志物策略，结合 GAs、通路活性、转录免疫特征和空间分辨免疫表型。这种多模态方法可识别免疫响应亚组，揭示原发性耐药机制，并优先考虑 ICI 的合理组合。本研究旨在全面绘制 iCCA 中跨分子定义亚型的 IC 表达和免疫结构，以指导生物标志物开发和下一代免疫治疗策略。

方法
多重免疫组化
研究队列由 144 例经组织学确认的 iCCA 患者组成，于 2000 年至 2019 年间在汉诺威医学院接受根治性手术切除。纳入标准为具备足够的福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织及相应的分子和临床数据，以便进行整合基因组、转录组和空间免疫分析。回顾性收集临床和病理数据。变量包括人口学特征、肿瘤形态、病理分期、肿瘤分级、淋巴结状态、切缘状态、血管侵犯、多中心性和生存结果。研究人群详细基线特征见补充表 S1，https://links.lww.com/HC9/C498。存档组织使用经汉诺威医学院当地机构审查委员会（IRB）/ 伦理委员会批准（批准号 3612-2017），研究符合《赫尔辛基宣言》和 2018 年《伊斯坦布尔宣言》原则。所有患者均提供书面知情同意。同一队列的独立分析已先前报道。10 我们使用了多组学数据，包括：(i) 量化不同组织区域内免疫细胞群体及其 IC 标志物表达的多重免疫组化（mIHC）数据。两个面板表征了细胞角蛋白 AE1/3 阳性肿瘤细胞、血管内皮细胞标记物 CD34 以及关键免疫标记物的空间分布，包括泛 T 细胞标记物 CD3、TIGIT 阳性、PD-1 阳性、LAG-3 阳性和 CTLA-4 阳性；(ii) 宏基因组 RNA 测序和 (iii) 面板 DNA 测序。

DNA 测序
在临床实验室改进修正案（CLIA）认证和美国病理学家学院（CAP）认可的实验室中，使用杂交捕获 FoundationOne CDx (F1CDx) 检测（Foundation Medicine, Inc., 美国波士顿）进行下一代测序，如先前所述。11

转录组分析
所有分析均在 Ubuntu 22.04.5 LTS 上的 RStudio 中使用 R (v4.4.3) 进行。使用基因集变异分析（GSVA）根据既定分类法将患者分配至间质 - 肿瘤 - 免疫微环境（STIM）类别。7,12 使用 Kaplan-Meier 生存曲线和 Cox 比例风险回归评估 STIM 类别间的生存差异。MCP-counter 是一种基于转录组的方法，利用各谱系特异性基因表达标记物估算组织浸润免疫和间质细胞群体的绝对丰度，用于将 RNA 测序数据解卷积为免疫和间质细胞群体。

为可视化和识别频繁 GAs，我们使用了 ComplexHeatmap，共发生和互斥改变模式使用 Maftools R 包评估。13,14 差异表达基因（DEGs）使用 DESeq2 鉴定。15 转录因子（TF）活性推断使用 decoupleR R 包和 CollecTRI 数据库进行，整合了 TF-靶标相互作用的先验知识。16 最后，进行 fgsea（快速基因集富集分析）以识别与 TIGIT 高表达患者差异表达基因相关的富集生物学通路。17

统计分析
所有统计分析使用 R 和 GraphPad Prism 进行。使用 Kaplan-Meier 分析时，以中位数为预定义截断值将患者分层为高和低组。使用 R 中的 survival 包进行生存分析。使用单变量和多变量 Cox 比例风险回归模型评估与生存结果的关联。连续和分类变量分别使用 Wilcoxon 秩和检验和 Fisher 确切检验进行比较。适当时使用 Benjamini-Hochberg 方法调整 p 值。图 2C、F 的统计分析在 GraphPad Prism 中进行。详细统计方法见补充方法，https://links.lww.com/HC9/C497。所有分析脚本公开可用：https://github.com/AnastasiiaKorosteleva/TIGIT-Expression-in-iCCA-Is-Associated-with-Immune-Activation-and-Regional-Heterogeneity/。

补充方法
有关 mIHC 和统计分析的附加信息见补充材料。

结果
转录组与基因组数据整合分析
共纳入 144 例切除性 iCCA 患者。队列基线临床病理特征汇总于补充表 1，https://links.lww.com/HC9/C498。为表征肿瘤免疫微环境，我们整合了转录组、基因组和 mIHC 数据。肿瘤根据 STIM 分类进行分层（图 1A），该分类基于肿瘤内在特征、间质组成和免疫微环境特征将 iCCA 分层为 5 个生物学独特亚型。7 在我们队列中，约 47% 肿瘤属于“炎症型”类别，包括免疫经典亚型（约 27.5%）和炎症间质亚型（约 19.5%）。其余 53% 被归类为“非炎症型”，包括沙漠样（约 12%）、肝干细胞样（约 27.5%）和肿瘤经典亚型（约 13.5%）。与关键研究一致，肝干细胞样亚型与最 favorable 的 OS 相关（图 1B）。相反，沙漠样和肿瘤经典亚型表现出最差的预后，反映更具侵袭性的肿瘤生物学。

共鉴定出 1507 个 GAs，包括单核苷酸变异（n=897）、小插入（n=74）和缺失（n=128），以及复杂结构事件如拷贝数改变（n=360）和基因融合（n=48）。前 5 位最常见 GAs 为 CDKN2A 缺失（30%）、CDKN2B 缺失（27%）、TP53 突变（22%）、MTAP 缺失（20%）和 BAP1 突变（19%）（图 1A）。其中几种改变显著与不利临床结果相关。具体而言，CDKN2A 缺失（HR=2.67）、CDKN2B 缺失（HR=2.42）、MTAP 缺失（HR=2.57）和 TP53 突变（HR=1.92）与较短 OS 相关（补充图 S1A、B，https://links.lww.com/HC9/C499）。最突出的共发生 GAs 包括 MTAP 缺失与 CDKN2A/B 缺失，KRAS/APC 与 TP53 改变并发，DIS3 与 APC 改变，以及 MCL1 扩增与 ATM 改变共发生（补充图 S1C，https://links.lww.com/HC9/C499）。相反，IDH1 突变与 MTAP 缺失、FGFR2 融合与 TP53、ARID1A 或 IDH1 突变、以及 KRAS 与 PBRM1 突变之间观察到了最强的互斥模式。

我们接下来检查了复发性 GAs 在 STIM 定义 TIME 类别中的分布（图 1A、C）。在沙漠样类别中，BRCA2 突变显著富集，发生率 30.8%，而其他类别为 6.0%（p=0.0137）。肝干细胞样组表现出独特的分子特征，总体与 Martin-Serrano 等人原始发表一致：7BAP1 突变显著过表达（37.5% vs 其他类别 11.1%；p=0.0012）。FGFR2 融合也显著更频繁（22.5% vs 7.8%；p=0.039），IDH1 突变患病率较高（27.5% vs 15.6%），尽管未达统计学显著性（p=0.147）。相反，几种抑癌基因改变和局灶缺失在肝干细胞样类别中发生较少：肝干细胞样肿瘤中 CDKN2A 缺失观察于 17.5%，而其他类别为 35.6%（p=0.0407）；CDKN2B 缺失 15.0% vs 33.3%（p=0.0348）；MTAP 缺失 7.5% vs 25.6%（p=0.018）；TP53 突变 7.5% vs 28.9%（p=0.0062）。相反，在炎症间质类别中，TP53 突变显著富集（41.7% vs 其他类别 17.9%；p=0.0266），KRAS 突变数值较高但无统计学显著性（25.0% vs 10.4%；p=0.087）。总之，这些结果揭示了关键致癌事件的类别特异性富集和减少，进一步支持 STIM 定义的微环境表型与独特潜在分子改变相关的假设。

在通路水平（图 1A，下板），使用 TCGA 衍生致癌信号签名进行的富集分析识别出 RTK-RAS（69%）、PI3K（41%）和 WNT（20%）为最常改变的级联。6 在 STIM 类别内，影响细胞周期通路的突变在炎症间质组中显著富集（21.9% vs 其他类别 7.6%；p=0.0257）。肿瘤经典类别显著富集 TGF-Beta 通路改变（22.7% vs 5.6%；p=0.0172）。

图 1
基于 STIM 的肝内胆管癌患者分层。(A) 使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）12 根据间质、肿瘤和免疫微环境（STIM）框架 7 对肿瘤进行分类。描绘了前 30 个最常见的遗传改变。通路和基因相应定义。6 (B) 比较 STIM 组间总生存期的 Kaplan-Meier 曲线。(C) 与每个 STIM 类别相关的差异遗传改变摘要（每个类别与所有其余样本比较）。p 值使用 Fisher 确切检验计算。

相比之下，免疫经典类中细胞周期通路突变的患病率显著较低（2.2%，而队列其余部分的患病率为13.4%；p=0.0428）。
**分区特异性免疫检查点表达**
为评估肝内胆管癌中IC表达的空间异质性，我们采用了一种分室采样策略，标注了感兴趣区域（ROIs），以捕获肿瘤核心、基质、侵袭边界和邻近肝组织，如先前所述（图2A）。这种空间解析的设计允许对比组织学上不同的区域之间的免疫特征，而非通过整体平均化进行比较。对于免疫表型分析，我们应用了靶向多重免疫组化（mIHC）面板，包含经典T细胞标志物以及血管内皮标志物CD34，同时包含关键IC（图2B）。CD3作为泛T细胞标志物，用于归一化检查点阳性比例；PD-1、TIGIT、LAG-3和CTLA-4则用于探究T细胞耗竭和调控的互补性途径。
**多重免疫组化分析肝内胆管癌的空间免疫景观。**
（A）将感兴趣区域（ROIs）放置于不同区域中，用于后续比较分析：肿瘤核心、肿瘤基质、肿瘤边缘和邻近肝脏。（B）代表性复合图像，展示CD3+ T细胞上所述免疫检查点的表达。（C）点图，显示肿瘤细胞（AE1/3+）、内皮细胞（CD34+）、T细胞（CD3+）及其他细胞在肿瘤核心、肿瘤边缘和肿瘤基质中的细胞密度（cells/mm2）。统计比较使用Kruskal-Wallis检验及Dunn事后检验。#表示在所有区域比较中具有统计学意义（p<0.05）。（D）根据组织区域，显示共表达所述检查点的CD3细胞密度，以及（E）其百分比。（F）CD3+ T细胞上检查点表达的区域特异性分布。统计比较使用Friedman检验。统计学显著性以*表示（p<0.05）。（G）瀑布图，展示患者间IC表达在不同区域间的瘤间异质性。病例按照队列中IC+表型占CD3+ T细胞总数的比例排列。

组织学分区间细胞类型分布的分析揭示了明显的空间模式（图2C）。如预期，肿瘤细胞在各组织区域中呈现明显的空间梯度，肿瘤核心中的密度最高[中位数（IQR）：3639.3（2712.2–4519.1）cells/mm2]，在侵袭边界[1090.2（661.4–1633.3）cells/mm2]和基质[616.3（246.7–821.2）cells/mm2]中明显降低。CD3+ T细胞在肿瘤核心中的中位密度最低[91.2（51.5–182.3）cells/mm2]，在基质[656.4（266.3–1328.7）cells/mm2]和侵袭边界[921.9（546.2–1500.1）cells/mm2]中逐渐升高，而邻近肝组织显示中间水平[572.5（332.2–851.8）cells/mm2]。以微血管密度为替代指标的内皮细胞（CD34）密度在肿瘤核心中较基质和边缘区域降低。各区域的中位值及IQR分别为：肿瘤核心163.9（107.8–276.6）cells/mm2，基质187.2（128.4–266.3）cells/mm2，边缘205.1（123.9–284.4）cells/mm2，邻近肝组织中密度最低[89.1（63.9–154.6）cells/mm2]。

在所有区域中，大多数浸润的CD3+免疫细胞对所检测的检查点均为阴性，包括肿瘤核心（86.9%）、肿瘤基质（88.1%）、肿瘤边缘（91.6%）和邻近肝组织（92.9%）（图2E）。在CD3+ T细胞中，TIGIT是跨所有区域最常被观察到的抑制性受体，无论是相对丰度还是密度均如此。TIGIT+ T细胞在肿瘤核心中占T细胞的4.6%，基质中占7.6%，侵袭边界中占4.2%，邻近肝组织中占4.9%。与此一致，TIGIT+ T细胞密度在基质区域最高[27.9（5.2–75.9）cells/mm2]，其次为边缘[18.8（7.3–62.8）cells/mm2]、肝组织[18.1（6.2–40.5）cells/mm2]，肿瘤核心中密度最低[1.8（0.5–5.1）cells/mm2]（图2D）。PD-1是第二常见的免疫检查点，在各区域间呈更均匀的空间分布。PD-1+ T细胞在肿瘤核心、基质、边缘和肝组织中分别占T细胞的2.9%、1.6%、2.4%和1.3%，对应的细胞密度从肿瘤核心中的0.6（0.0–2.6）cells/mm2到边缘的5.0（0.7–26.2）cells/mm2不等，基质[2.1（0.0–11.1）cells/mm2]和肝组织[2.1（0.0–8.2）cells/mm2]中密度居中。

LAG-3表达相对稀少，且主要限于肿瘤相关区域。LAG-3+ T细胞在肿瘤核心中占T细胞的2.7%，基质中占0.9%，边缘中占0.6%，但在肝组织中罕见（0.1%）。与此相符，LAG-3+ T细胞密度在核心[0.5（0.0–2.4）cells/mm2]、基质[2.0（0.6–6.3）cells/mm2]和边缘[1.9（0.0–5.9）cells/mm2]中可检测到。CTLA-4是最少见的免疫检查点，在所有区域中占T细胞的≤1%（核心1%、基质0.3%、边缘0.3%、肝组织0.2%）。相应地，CTLA-4+ T细胞密度在各区域均较低，中位值及IQR为：肿瘤核心0.4（0.0–1.1）cells/mm2、基质1.0（0.0–3.7）cells/mm2、边缘1.6（0.4–3.5）cells/mm2、肝组织0.3（0.0–1.2）cells/mm2。这些发现与先前一项研究的结果一致，该研究描述肿瘤核心为"冷"中心，与侵袭边界相比，T细胞更少，IC表达更低。

同一T细胞上多种IC的共同表达较为少见（图2D、E）。TIGIT+/PD-1+双阳性T细胞在肿瘤核心中占T细胞的0.5%，基质中占1.1%，边缘中占0.7%，肝组织中占0.6%，最高密度见于基质[0.9（0.0–8.3）cells/mm2]。TIGIT+/LAG-3+ T细胞在所有区域中均罕见（≤0.4%），而PD-1+/LAG-3+双阳性T细胞在肿瘤核心中最常见（1%）。

以IC为中心的分析（图2F）证实TIGIT是基质区域中的主要抑制性受体，在该区域显示出最高表达水平[39.5（8.5–116.9）cells/mm2]。相比之下，PD-1表达在侵袭边界处特别富集[5.6（0.9–28.3）cells/mm2]。LAG-3阳性主要见于基质[2.1（0.6–7.6）cells/mm2]，而CTLA-4在基质[1.0（0.0–4.0）cells/mm2]和边缘[1.4（0.4–3.6）cells/mm2]中显示出低但可检测的表达水平，与其总体罕见性一致。图2G展示了iCCA肿瘤微环境中IC表达的瘤内/瘤间异质性。

**IC表达与预后的相关性**
我们进一步评估了IC表达在各空间区域中的预后意义（图3）。Cox比例风险模型显示，在多重检验校正后，大多数IC表达细胞亚群与预后的统计学关联不显著（图3A）。若干细胞类型特异性变量，包括内皮细胞和PD-1+/LAG-3+双阳性T细胞，显示出与预后的提示性关联；然而，在包含相关临床协变量的多变量调整后，这些关联不再显著（图3A及补充图S4）。
**肝内胆管癌中免疫检查点表达T细胞群体的预后意义。**
（A）Cox比例风险回归模型示意图，用于评估组织区域间免疫细胞群体与患者生存之间的关联。（B）箱线图，显示免疫检查点阴性T细胞（CD3+/TIGIT?/PD-1?/LAG-3?/CTLA-4?）在各组织区域中的分布。统计比较使用Wilcoxon检验及Benjamini-Hochberg校正。显著性水平以*表示（校正后p<0.05）。（C）根据肿瘤核心中免疫检查点阴性T细胞的丰度分层的Kaplan-Meier生存分析。最低四分位数（25%）患者与其余所有患者进行比较。生存差异使用对数秩检验评估。（D）根据肿瘤基质区域分割肿瘤面积中CD3+/TIGIT?/PD-1?/LAG-3+/CTLA-4?细胞在CD3+ T细胞中的比例分层的Kaplan-Meier生存曲线（详见补充方法）。以中位值（0）为截断值，将检测不到该细胞群体水平的患者与检测到该水平的患者进行比较。生存差异使用对数秩检验评估。（E）根据肿瘤核心（基质亚区域）中CD3+/TIGIT+/PD-1?/LAG-3?/CTLA-4?细胞在CD3+ T细胞中的比例分层的Kaplan-Meier生存曲线。以中位值为截断值，生存差异使用对数秩检验评估。

IC阴性（IC?）CD3+ T细胞比例最低的区域为肿瘤核心，其次是基质和侵袭边界（图3B），其中IC? CD3+ T细胞定义为CD3+/TIGIT?/PD-1?/LAG-3?/CTLA-4?细胞在总CD3+细胞中的比例。以IC? T细胞频率的第25百分位数为截断值，Kaplan-Meier分析表明，肿瘤核心中IC? T细胞比例较高与总生存期显著改善相关（图3C）；在基质或边缘中未观察到类似关联。图3C中Kaplan-Meier图的基于四分位数的分析（补充图S3A、B）表明，肿瘤核心中IC? CD3+ T细胞少于25%的患者与队列其余部分相比，生存效应最为明显。

对单个IC的空间解析分析也揭示了区域特异性效应（图3D、E及补充图S2A）：肿瘤基质ROI中肿瘤区域的LAG-3+ T细胞密度与较差的生存相关（p=0.038；图3D），这与LAG-3+ T细胞的免疫抑制功能一致。图3D–E以中位数为截断值。相比之下，肿瘤核心ROI中基质区域TIGIT+ T细胞密度较高与总生存期改善相关（p=0.045；图3E），提示在此背景下，TIGIT表达可能标记部分活跃的T细胞群体，或反映高抗原暴露位点的代偿性免疫应答。这些结果表明，iCCA中IC表达的预后意义具有异质性和上下文依赖性，凸显了在生物标志物开发中进行区域特异性免疫图谱分析的需要。

**IC+ T细胞与邻近肿瘤细胞的邻近性分析**
我们进一步分析了表达IC的T细胞与邻近肿瘤细胞之间的空间关系（图4A）。尽管IC+ T细胞到最近肿瘤细胞的距离在不同IC之间差异不大，但总体而言T细胞的邻近性因肿瘤区域而异。如预期，在肿瘤核心中，T细胞通常位于距最近肿瘤细胞几十微米范围内；在基质中距离较大（约50–100 μm）；在侵袭边界中距离居中（约25–50 μm）（图4B）。在分析特定的IC+/CD3+ T细胞亚群时，CD3+/LAG-3+细胞在所有区域中与IC? CD3+ T细胞相比，与肿瘤细胞的邻近性始终更近（核心、基质和边缘p_adj<0.05）。相比之下，CD3+/PD-1+ T细胞在肿瘤核心中距离肿瘤细胞更远（核心：p_adj<0.05；基质和边缘：ns），而双阳性CD3+/PD-1+/LAG-3+ T细胞在核心和边缘中均位于更靠近肿瘤细胞的位置（核心和边缘：p_adj<0.05；基质：ns）。CD3+/TIGIT+ T细胞在基质和边缘中距离肿瘤细胞更远，在核心中未观察到显著的空间差异（基质和边缘：p_adj<0.05；核心：ns）。IC+ T细胞的空间定位可能反映了其在肿瘤微环境中的不同功能角色。
**免疫检查点表达T细胞与肿瘤细胞间的距离。**
（A）肿瘤-T细胞距离测量的代表性可视化。CD3+细胞以绿点表示，细胞角蛋白AE1/3表达（红色）作为肿瘤细胞的替代标志物。（B）箱线图，比较CD3+细胞到最近表达无（IC?）或指定检查点的肿瘤细胞之间的距离。来源细胞类型显示在x轴上。比较表达无免疫检查点（IC?）或指定检查点的CD3+细胞到最近肿瘤细胞距离的箱线图。来源细胞类型显示在x轴上。统计比较使用Wilcoxon检验及Benjamini-Hochberg校正；*表示校正后p<0.05。CD3+/IC?细胞定义为CD3+/TIGIT?/PD-1?/LAG-3?/CTLA-4? T细胞。（C）Cox比例风险回归分析，识别与患者生存相关的基于距离的免疫细胞指标。统计显著性通过Benjamini-Hochberg校正p值确定。（D、E、F、G）根据中位距离值分层的Kaplan-Meier生存曲线。分析使用分割的肿瘤和基质区域进行，如补充方法所述。

**免疫细胞定位的生存分析**
为评估空间免疫细胞分布的预后影响，我们使用连续距离指标进行Cox比例风险模型分析，并以Kaplan-Meier分析作为补充（图4C、D）。尽管Cox回归未发现统计学显著关联，但若干不显著趋势提示免疫细胞与肿瘤细胞的邻近性可能影响预后。

讨论

在这项整合了144例可切除iCCA、结合了基于STIM的转录组学、下一代测序和区室化多重免疫组化的研究中，我们展示了微环境类别、基因型和空间免疫结构相互依存，并定义了具有临床意义的iCCA亚群。这些发现完善了先前的分类器，并对这种免疫治疗获益有限的疾病的生物标志物开发和治疗选择具有实用意义。

STIM分类可靠地将肿瘤分为炎症型（47%）和非炎症型（53%）两组，且两组预后有显著差异：肝干细胞样型肿瘤的总生存期最佳，而沙漠样型和治疗经典型最差。重要的是，STIM类别与特定的基因组模式相关。肝干细胞样型肿瘤富集BAP1突变和FGFR2融合，CDKN2A/B、MTAP和TP53改变减少；沙漠样型肿瘤显示BRCA2富集；炎症基质型肿瘤携带更多TP53改变，呈现KRAS趋势，细胞周期通路参与增加。这些关联支持一种模型，即癌基因程序和基质/免疫微环境相互塑造肿瘤行为。

空间分析揭示了免疫检查点表达和免疫细胞定位的显著区室异质性，这是整体检测方法所掩盖的。TIGIT在基质中占主导地位，PD-1在侵袭边缘相对富集，而LAG-3和CTLA-4呈灶性且局限于核心区域。炎症基质型类别表现出高密度的耗竭/检查点阳性T细胞（TIGIT+、TIGIT+/PD-1+、TIGIT+/LAG-3+），而肝干细胞样型肿瘤这些亚群的密度最低。这些STIM特异性耗竭特征暗示了不同的免疫参与机制：炎症基质型肿瘤含有抗原经历但受抑制的T细胞，可能易于接受联合检查点策略，而肝干细胞样型肿瘤在免疫上显得更"冷"，可能更适合靶向治疗或免疫预处理方法。

基质中的LAG-3+ T细胞与更差的总生存期相关，而基质中TIGIT+ T细胞和肿瘤核心中更高比例的免疫检查点阴性T细胞则与更好的预后相关。接近度指标显示LAG-3+细胞更靠近癌细胞，而PD-1+细胞在核心区域相对更远离。这些发现可能表明检查点表达的预后意义取决于标志物身份和解剖学区室，这要求开发区域感知的生物标志物检测。

TIGIT在我们的队列中是最常表达的检查点，值得重点讨论。对TIGIT高表达肿瘤的转录组学和基因组学分析揭示了TCR/BCR信号传导、干扰素反应和抗原提呈的协同上调，以及免疫调节通路和独特的基因组组合（包括APC、CDKN2A、DIS3突变的富集以及AKT2扩增等）。这种分子特征提示TIGIT表达反映了活跃且持续的T细胞参与，其中抑制性信号发挥补偿作用，而非不可逆的终末T细胞耗竭。在我们的数据中，TIGIT表达和某些空间特征与适度改善的总生存期相关，这与抗原参与的、部分活跃的免疫补偿标志物一致。文献显示TIGIT的预后作用存在上下文依赖性：跨癌症的荟萃分析通常将高TIGIT表达与更差的预后联系起来，但疾病特异性研究报告了小细胞肺癌、肺腺癌和慢性淋巴细胞白血病等实体中的保护作用。机制上，联合TIGIT和PD-1阻断可以扩增非耗竭T细胞并恢复效应功能。与此原理一致，靶向PD-1和TIGIT的双特异性抗体rilvegostomig目前正在胆管癌中进行积极的临床开发。我们观察到TIGIT高表达的iCCA肿瘤显示免疫激活特征和有利的空间T细胞定位，这提示抗TIGIT联合疗法，特别是与PD-1/PD-L1抑制剂联合，值得在胆管癌中进行研究，并且对于炎症基质型肿瘤可能尤为重要。

我们研究的局限性包括单中心可切除队列、靶向而非全微环境空间面板，以及限制某些比较效力的亚组大小。此外，免疫分析仅限于原发肿瘤和邻近组织区室，包括肿瘤核心、基质、侵袭边缘和邻近肝组织。虽然这种方法为了解局部肿瘤免疫微环境的空间组织提供了详细见解，但它无法捕捉肿瘤引流淋巴结或外周循环中发生的免疫反应。这些区室可能提供关于T细胞启动、系统性免疫激活、迁移和免疫耗竭的补充信息，并可进一步完善免疫治疗的生物标志物开发。未来研究整合空间肿瘤分析与淋巴结和循环免疫细胞群体的分析，对于更好地理解局部和系统性抗肿瘤免疫之间的相互作用将很重要。尽管如此，明确的空间模式和基因型-表型耦合支持了我们发现的稳健性。

临床上，我们的数据表明STIM分类加上靶向基因组学分析可以将iCCA分为具有不同脆弱性的亚组；空间分辨的检查点图谱可以整合到生物标志物开发中；在胆管癌TIGIT联合治疗的进行临床试验中进行探索性事后分析时应纳入基于转录组的分层，如STIM分类。

总之，整合STIM、基因组学和空间免疫表型揭示了iCCA中层状的异质性，这些异质性塑造了预后和治疗机会。超越单一区域的检测读数，采用转录组指导的、空间分辨的、多模态检测将是更好地预测免疫治疗获益和设计iCCA合理联合策略的关键。