《Frontiers in Microbiology》：Prevalence and quantification of viable Campylobacter species in retail chicken: a comparative study using viability digital polymerase chain reaction and conventional culture methods
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弯曲杆菌属(Campylobacter)是一种主要食源性病原体，对公众健康构成重大威胁，常与食用未煮熟的禽肉有关。虽然传统微生物培养仍是检测的金标准，但它常无法检出处于活的但不可培养（VBNC）状态的细菌，可能低估对消费者的风险。为解决这一局限，研究人员开展了
弯曲杆菌属(Campylobacter)是一种主要食源性病原体，对公众健康构成重大威胁，常与食用未煮熟的禽肉有关。虽然传统微生物培养仍是检测的金标准，但它常无法检出处于活的但不可培养（VBNC）状态的细菌，可能低估对消费者的风险。为解决这一局限，研究人员开展了一项为期一年的零售鸡肉流行病学调查，采用叠氮溴化丙锭-数字聚合酶链式反应（PMA-dPCR）方法。在2025年2月至2026年1月期间，从三家当地超市共采集120份零售鸡肉样品（每月10份）。对PMA-dPCR与传统培养法的比较分析显示，不含增强剂的PMA-dPCR的总体检出率（55.0%）高于直接培养法（43.3%）和增菌培养法（46.7%），而含有增强剂的PMA-dPCR检出率较低（33.3%）。具体而言，在研究期间的多个月份中检测到PMA-dPCR阳性/培养阴性样品，表明零售禽肉供应链中存在膜完整的弯曲杆菌种群，其中可能包括VBNC状态的细胞。尽管早春季节检出率较低，PMA-dPCR仍能检出传统培养法未能检出的膜完整弯曲杆菌种群。这些结果突显了PMA-dPCR等先进分子工具在更全面评估弯曲杆菌污染方面的价值。
研究背景与目的：弯曲杆菌属(Campylobacter)尤其是空肠弯曲杆菌(C. jejuni)和结肠弯曲杆菌(C. coli)是全球食源性胃肠炎的主要病原菌。日本近年监测显示零售禽肉弯曲杆菌污染率较高，传统培养法虽为金标准，但无法检出活的但不可培养（VBNC）状态的细胞，导致风险低估；而常规PCR虽灵敏但不区分细胞活性，可能因死细胞DNA产生假阳性。为克服这一矛盾，研究者将叠氮溴化丙锭(PMA)处理与数字PCR(dPCR)结合，即PMA-dPCR，以实现对膜完整细胞的绝对定量。本研究旨在通过比较培养法、dPCR、PMA-dPCR（含/不含增强剂）等方法，评估零售鸡肉中膜完整弯曲杆菌的全年流行率与数量，并探讨菌群膜完整性差异。
研究设计与方法：研究人员于2025年2月至2026年1月从日本岐阜县三家当地超市每月采集10份冷藏整鸡腿样品，共120份。样品经磷酸盐缓冲液冲洗、离心浓缩后，将悬浮液分为5份平行分析：直接琼脂平板计数、增菌培养、dPCR（无PMA）、PMA-dPCR（无增强剂）、PMA-dPCR（含增强剂）。培养法采用改良CCDA平板和Preston增菌肉汤；PMA处理使用PMAxx试剂并设有无PMA增强剂两种条件；DNA提取采用DNeasy试剂盒；dPCR采用QIAcuity系统，靶向16S rRNA基因。拷贝数除以3（假设每细胞3拷贝）换算为细胞当量。统计采用Friedman检验、Wilcoxon符号秩检验和McNemar检验。
研究结果：3.1 检测方法比较：120份样品中，直接培养检出52份（43.3%），Preston增菌培养检出56份（46.7%），dPCR（无PMA）检出87份（72.5%），PMA-dPCR（无增强剂）检出66份（55.0%），PMA-dPCR（含增强剂）检出40份（33.3%）。PMA处理显著降低检出率，增强剂进一步降低。夏季（7-9月）检出率较高，早春较低。配对比较显示，PMA-dPCR（无增强剂）与两种培养法的检出差异均无统计学意义，表明存在样本层面的不一致。
3.2 分子方法定量比较：三个分子方法的估计细胞当量存在显著差异（Friedman检验P<0.001）。中位数分别为：dPCR 54.3个细胞当量/25g，PMA-dPCR无增强剂17.7个，PMA-dPCR含增强剂0个，两两比较均显著。代表性样品显示PMA处理降低计数，增强剂进一步降低或消除信号。
讨论总结：研究者指出，dPCR无PMA检出率最高，提示部分信号源自死细胞或膜受损细胞。PMA-dPCR仍检出培养阴性样品中的膜完整弯曲杆菌，可能包含VBNC细胞但未经直接证实；增强剂进一步降低信号，表明肉中弯曲杆菌生理状态存在异质性。夏季高发现象与既往报道一致。局限性包括采样地域有限、未能直接证实VBNC状态、16S rRNA基因拷贝数假设、未建立正式检出限等。
研究结论（翻译）：尽管存在上述局限性，本研究发现表明，PMA-dPCR为评估禽肉中膜完整弯曲杆菌种群提供了有用手段。特别是，比较有无增强剂的PMA处理，可进一步揭示零售鸡肉产品中弯曲杆菌种群在膜完整性方面的差异。这些方法有助于开发用于禽类加工和食品安全管理的快速、实用监测系统。
