硫酸化多糖包覆玉米醇溶蛋白纳米粒增强补骨脂素乳腺癌递送与治疗

《Frontiers in Pharmacology》：Sulfated polysaccharide-coated protein nanoparticles for enhanced delivery of psoralen in breast cancer therapy

　　

引言：补骨脂素（psoralen, PSO）是一种在乳腺癌管理中具有潜在作用的抗癌剂。然而，其临床应用受到水溶性差和生物利用度低的显著限制。因此，开发先进的 PSO 递送系统对于增强其治疗潜力至关重要。
方法：本研究通过将 PSO 包封于玉米醇溶蛋白（zein）纳米粒（nanoparticles, NPs）中，随后用岩藻多糖（fucoidan, Fu）进行表面修饰，构建了一种新型纳米递送平台，即 PSO-Z/F NPs。
结果：成功的表面修饰通过 ζ 电位由正值逆转为 ?24.8 ± 0.02 mV、粒径增加至 129.23 ± 0.18 nm、硫酸盐相关傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）谱带的特征性变化以及 X 射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）中 S 2p 信号的出现得到证实。PSO-Z/F NPs 呈均匀球形形态，包封率为 73.13 ± 0.98%，载药量为 5.40 ± 0.35%。PSO-Z/F NPs 的细胞摄取较未包覆的 PSO-Z NPs 高 1.6 倍（P < 0.05）。体外，PSO-Z/F NPs 显著抑制 4T1 乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。具体而言，伤口闭合率从对照组的 29.13 ± 3.33% 降至 5.02 ± 2.86%（P < 0.001）。与 PSO 组相比，迁移细胞数从 220 ± 33 降至 146 ± 20（P < 0.01），侵袭细胞数从 144 ± 21 降至 90 ± 8（P < 0.05）。此外，PSO-Z/F NPs 将总凋亡率从对照组的 6.45% 提高至 17.98%（P < 0.01）。另外，溶血实验显示溶血活性降低，而血清孵育研究证实胶体稳定性改善，表现为 7 天内粒径和多分散指数（polydispersity index, PDI）变化极小。值得注意的是，在 4T1 荷瘤小鼠中，肿瘤和主要器官的体内和离体荧光分析显示 PSO-Z/F NPs 可有效蓄积于肿瘤，药效学研究提示其可增强肿瘤生长抑制，并具有可接受的生物安全性。
讨论：总体而言，PSO-Z/F NPs 可能提供一种基于纳米粒的递送策略，以改善补骨脂素在乳腺癌中的治疗应用。

乳腺癌目前是女性最常见的癌症，治疗手段包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗和免疫治疗，但仍存在内分泌治疗原发或获得性耐药、三阴性乳腺癌缺乏明确治疗靶点、侵袭性强以及复发和转移风险高等问题。补骨脂素（psoralen, PSO）是一种天然呋喃香豆素化合物，具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤和逆转耐药等特性，可通过诱导细胞周期阻滞和细胞死亡、抑制转移和血管生成发挥抗肿瘤作用；在乳腺癌中，PSO 可激活磷酸化 IRAK1 和 NF-κB 诱导凋亡，改变 β-catenin 表达，降低基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP-2/MMP-9）并抑制上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），还可与化疗药物协同并逆转多药耐药。但 PSO 水溶性差、生物利用度低，限制其临床应用。纳米递送系统是解决这些限制的重要途径。玉米醇溶蛋白（zein）和岩藻多糖（fucoidan, Fu）为高生物相容性和可降解的天然聚合物，适合递送疏水性药物。Fu 是一种海洋硫酸化多糖，在肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中可选择性结合 L-选择素、Toll 样受体和过表达 P-选择素受体，具有肿瘤治疗潜力。已有研究表明，Zein-Fucoidan 纳米系统可被肿瘤细胞显著摄取并产生细胞毒性，Fu 包覆可提高包封率和稳定能力，增强对转移肿瘤细胞的结合并抑制侵袭。因此，研究人员构建 PSO-Z/F NPs，以改善 PSO 的递送性能和乳腺癌治疗潜力。研究结果表明，PSO-Z/F NPs 可增强细胞摄取，抑制 4T1 乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，诱导凋亡，具有 pH 响应释放、血清稳定性和低溶血性，并在 4T1 荷瘤小鼠中增强肿瘤蓄积和抑瘤作用，初步生物安全性可接受；提示其可能为改善 PSO 乳腺癌治疗提供一种纳米递送策略，但仍需进一步研究其生物分布、长期安全性、靶向性能和转化潜力。

为开展研究，研究人员采用反溶剂沉淀法，将 PSO 包封于 zein 纳米粒，并通过静电作用在表面包覆 Fu，构建 PSO-Z/F NPs；以高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）定量 PSO，结合透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、粒径与 ζ 电位、FTIR、XPS、X 射线衍射仪（X-ray diffractometer, XRD）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）和圆二色光谱（circular dichroism, CD）表征理化性质与二级结构；采用透析袋法考察 pH 响应释放，以血清孵育、药物泄漏和溶血实验评价稳定性与血液相容性；在 4T1 小鼠乳腺癌细胞中开展 CCK-8、FITC/Cy5.5 标记细胞摄取、划痕、Transwell、Annexin V-FITC/PI 凋亡实验；以雌性 BALB/c 小鼠 4T1 皮下荷瘤模型进行体内/离体荧光成像、抗肿瘤药效及 H&E、TUNEL 组织学评价。样本来源为 4T1 小鼠乳腺癌细胞和 BALB/c 小鼠。

研究结果如下。3.1 PSO-Z/F NPs 的表征：3.1.1 PSO 分析：HPLC 标准曲线在 5–80 μg/mL 范围内线性良好，R²=0.9992，空白 Z/F NPs 在 PSO 保留时间无干扰峰，方法特异性良好。3.1.2 形貌、粒径、ζ 电位、EE 和 DL：TEM 显示纳米粒呈近球形；PSO-Z/F NPs 粒径由 PSO-Z NPs 的 92.13 ± 0.74 nm 增至 129.23 ± 0.18 nm；空白 Z/F NPs 为 135.75 ± 0.92 nm，可能因药物诱导 zein 基质压缩。ζ 电位由正值转为 ?24.8 ± 0.02 mV，Fu 的硫酸基和羧基贡献负电荷，证明其有效附着。EE 为 73.13 ± 0.98%，DL 为 5.40 ± 0.35%。3.1.3 FTIR：天然 zein 的 1,600 cm^-1 峰在 PSO 包封后红移至 1,610 cm^-1，提示 β-折叠聚集形成；PSO 的 1,715 cm^-1 C=O 峰在 PSO-Z 和 PSO-Z/F NPs 中消失，因 PSO 被稳定包封于 zein 疏水微腔，疏水作用和 π–π 堆积屏蔽 C=O；Fu 包覆后峰移至 1,272 和 827 cm^-1，提示 Fu 硫酸基与 zein 极性基团间存在氢键和静电作用；O-H 与 N-H 伸缩峰重叠使 3,447 cm^-1 峰更宽更强，验证界面相互作用。3.1.4 XPS：纯 PSO 的 C 1s 为 284.8 eV、O 1s 为 532.62 eV；PSO-Z NPs 出现 N 1s 399.85 eV，O 1s 负移至 532.0 eV；PSO-Z/F NPs 的 O 1s 进一步负移至 531.63 eV，N 1s 变为 399.29 eV，并出现 S 2p 168.52 eV。结果支持氢键、静电吸引和疏水相互作用，S 2p 证实 Fu 成功包覆。3.1.5 XRD 和 DSC：PSO 呈高度结晶；PSO-Z/F NPs 无特征峰，为无定形。DSC 中 PSO 结晶熔融峰消失，表明 PSO 以无定形或分子分散状态存在于 zein 核中，未重结晶。3.1.6 CD：zein 以 α-螺旋为主，PSO 负载后螺旋带减弱，向 β-折叠和无规卷曲转变；Fu 单独无 CD 信号，包覆后复合物 CD 强度中度增加，由氢键和静电作用稳定构象；PSO 为非手性小分子，无新特征峰提示其物理包封于疏水核。3.1.7 响应释放：48 h 累积释放率在 pH 5.5、6.5 和 7.4 下分别为 92.4 ± 3.3%、52.4 ± 1.0% 和 39.1 ± 1.3%，显示 pH 响应释放。3.1.8 体外稳定性：PSO-Z NPs 在血清中粒径先增至约 800 nm 后下降，均无不可逆聚集或沉淀；PSO-Z/F NPs 粒径保持稳定，Fu 亲水壳可屏蔽表面电荷、抑制非特异蛋白吸附并防止瞬时聚集；7 天内药物泄漏率低于 10%。3.1.9 溶血实验：Z/F NPs、PSO-Z NPs 和 PSO-Z/F NPs 溶血率均小于 3%，血液安全性良好。

3.2 体外细胞毒性与细胞摄取：3.2.1 体外细胞毒性：CCK-8 显示 PSO-Z NPs 比游离 PSO 细胞毒性更强，Fu 包覆后 PSO-Z/F NPs 进一步增强，Z/F NPs 毒性可忽略。3.2.2 细胞摄取实验：FITC 标记后，PSO-FITC@Z/F NPs 在 4T1 细胞中的荧光强度为 PSO-FITC@Z NPs 的 1.6 倍，内化效率更高。3.3 伤口愈合、细胞迁移和侵袭实验：划痕 48 h 愈合率由对照组的 29.13 ± 3.33% 降至 PSO-Z/F NPs 组的 5.02 ± 2.86%；Transwell 中迁移细胞由 PSO 组的 220 ± 33 降至 146 ± 20（P < 0.01），侵袭细胞由 144 ± 21 降至 90 ± 8（P < 0.05），提示抑制迁移和侵袭。3.4 凋亡实验：Annexin V-FITC/PI 流式显示 Z/F NPs 凋亡率为 9.86%，与对照组 6.45% 无显著差异；PSO-Z/F NPs 凋亡率升至 17.98%（P < 0.01），且显著高于游离 PSO 组（P < 0.05），提示更有效的细胞摄取。3.5 体内生物分布：Cy5.5 标记纳米粒在 4T1 荷瘤小鼠中主要分布于肿瘤、肝和肺；PSO-cy5.5@Z/F NPs 荧光逐渐升高，24 h 达峰，96 h 肿瘤区仍明显；PSO-cy5.5@Z NPs 趋势相似但荧光更低，12 h 达峰，提示 PSO-Z/F NPs 肿瘤蓄积和滞留增强。3.6 体内抗肿瘤疗效：在 4T1 荷瘤小鼠中每 3 天静脉给药，14 天后 PSO-Z/F NPs 组肿瘤生长较 PBS 和游离 PSO 组显著抑制（P < 0.05），肿瘤体积和重量最小；Z/F NPs 无显著抗肿瘤作用；体重无明显下降。3.7 体内生物安全性分析：H&E 染色显示主要器官未见明显治疗相关病理异常；TUNEL 染色显示 PSO-Z/F NPs 组肿瘤组织凋亡信号明显，且强于 PSO 组，对照组无 TUNEL 阳性信号。

讨论与结论部分指出，PSO-Z/F NPs 可能为改善 PSO 乳腺癌治疗提供潜在纳米粒递送策略。结论原文翻译：研究人员利用具有天然生物活性的 zein 和 Fu 作为纳米载体递送 PSO 治疗乳腺癌。光谱分析提示 PSO 诱导 Zein 构象重排，表现为部分 α-螺旋解旋和蛋白链去折叠，可能形成更大疏水区域以容纳药物；同时这些构象变化可能通过额外氢键、静电接触和疏水缔合增强 Zein 与 Fu 界面相互作用，共同驱动更紧凑纳米粒核心，提高结构稳定性。制备的 PSO-Z/F NPs 具有纳米尺度、低 PDI、pH 敏感、缓释、低药物泄漏率和低溶血率。体外实验提示其强细胞毒性，显著诱导 4T1 乳腺癌细胞凋亡并抑制侵袭。体内评价表明，在测试条件下 PSO-Z/F NPs 具有可接受的初步生物相容性，盲法组织病理学评价未在主要器官观察到明显治疗相关异常，治疗期间无显著体重下降，提示可接受的初步体内耐受性。该制剂还与肿瘤部位药物蓄积增强相关，可能促成观察到的肿瘤生长抑制。总体而言，硫酸化多糖包覆蛋白纳米粒为增强 PSO 乳腺癌治疗应用提供有前景的递送方法。仍需进一步研究系统循环特征、长期安全性、抗肿瘤机制和转移模型疗效；局限性包括缺乏全面安全性评价和不完整对照组，未来应纳入全面安全评估和适当对照组以验证生物安全性并厘清 Fu 包覆贡献。