《Frontiers in Genetics》：AI and computational methods for reconstructing cell-state-specific gene regulatory networks from single-cell transcriptome and chromatin accessibility data in cancer: methods, applications, and perspectives
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肿瘤异质性由遗传、表观遗传、微环境和随机因素共同塑造，其中细胞状态特异性调控程序是主要决定因素。基因调控网络（gene regulatory networks，GRNs）提供了连接转录因子、顺式调控元件和靶基因的系统层面模型。配对单细胞RNA测序（single
肿瘤异质性由遗传、表观遗传、微环境和随机因素共同塑造，其中细胞状态特异性调控程序是主要决定因素。基因调控网络（gene regulatory networks，GRNs）提供了连接转录因子、顺式调控元件和靶基因的系统层面模型。配对单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）和单细胞转座酶可及染色质测序（single-cell assay for transposase-accessible chromatin using sequencing，scATAC-seq）可在同一细胞中测量染色质可及性和基因表达，直接反映调控元件与转录输出之间的关系；匹配但未配对（matched-but-unpaired）、插补（imputed）及单模态（single-modality）设计可扩大覆盖范围，但会引入额外假设和伪影。本迷你综述聚焦于人工智能（artificial intelligence，AI）和计算方法，用于从癌症单细胞转录组和染色质可及性数据中重建细胞状态特异性GRNs。研究人员定义了纳入标准，区分了同细胞配对、匹配未配对、插补和单模态设计，并按推断目标和输入需求对方法进行了分类。综述涵盖了基序/共可及性推断、深度整合与图学习、动态与细胞状态特异性建模以及虚拟扰动。随后，研究人员讨论了这些方法在上皮-间质转化、治疗耐药、谱系可塑性和肿瘤亚型分析中的应用，强调了从统计关联到方向性预测、计算机模拟扰动及实验支持的因果调控的证据层级。最后，研究人员审视了基准测试、局限性和转化前景。这些方法可能有助于将GRNs从描述性图谱转化为可检验的肿瘤调控模型，但其临床效用仍需前瞻性验证。
论文主体部分总结如下：
**1 引言**
肿瘤的进展、耐药和复发并不能完全由单个驱动突变解释，肿瘤内的细胞状态异质性及状态间的转换日益被认为是决定临床行为的关键因素。细胞状态由转录因子、顺式调控元件和靶基因组成的基因调控网络（GRNs）维持和切换。重建肿瘤细胞状态特异性GRNs为预测耐药、识别靶点和设计联合治疗策略提供了计算基础。传统的GRN推断依赖批量转录组或仅scRNA-seq数据，批量数据混合了细胞类型和状态，单模态表达数据无法区分转录因子表达与转录因子活性，也无法将远端增强子分配给其靶基因。联合分析技术（如sci-CAR、SNARE-seq、SHARE-seq、Paired-seq和10x Multiome）现已能在同一细胞中捕获染色质可及性和基因表达，为增强子-启动子-基因关系提供直接证据。AI方法适合处理单细胞多组学数据的高维性、稀疏性和非线性。深度生成模型可插补或生成缺失模态，图神经网络显式表示基因、峰和细胞间的关系，注意力机制和基础模型尝试跨细胞类型学习调控语法。现有综述大多按类别组织方法或覆盖广泛癌症应用，未聚焦于从配对scRNA-seq和scATAC-seq数据重建细胞状态特异性GRN。本综述以此为核心，从数据基础到AI方法族、癌症应用、验证和解释，再到开放问题。综述区分了四个常被混淆的证据层级：统计关联、方向性调控预测、计算机模拟扰动和实验支持的因果调控，并界定了纳入标准，排除了仅基于批量数据或仅基于序列预测的方法。
**2 配对单细胞多组学数据：技术基础与挑战**
sci-CAR于2018年首次在同一细胞中测量染色质可及性和mRNA，通过协方差将顺式调控位点与靶基因联系起来。SNARE-seq结合液滴式单核分析提高了通量，SHARE-seq引入了“染色质潜力”概念，Paired-seq将通量扩展到数百万细胞。这些方法确立了同细胞双模态数据范式，成为当前配对多组学GRN推断的基础。深度生成模型提供了计算替代方案，如scMVP使用多视图变分自编码器整合多组学数据，scMOG可生成计算机模拟的scATAC谱。配对单细胞数据也带来分析挑战：缺失值和测序深度差异大，scATAC-seq尤其稀疏，降低了峰-基因关联的信噪比；缺失并非随机，低表达转录因子可能缺失；批次和平台差异可能掩盖真实细胞状态信号；远端增强子-启动子关系、基序简并和等位基因特异性效应使方向推断困难。概念上，配对数据改变了推断问题：可及性反映调控潜力，表达反映输出，两者关系既非瞬时也非确定，方法应建模时间滞后、间接效应和情境依赖的布线。输入数据分为四类：同细胞配对、匹配未配对、插补/转移和单模态设计，不同设计需要相应的锚定或敏感性分析。
**3 用于GRN推断的AI框架**
根据建模策略，当前方法分为四类：基于基序和共可及性的推断、深度整合与图学习、动态与细胞状态特异性推断，以及虚拟扰动。
第一类依赖基序和共可及性。SCENIC从scRNA-seq推断GRN，SCENIC+扩展至配对多组学数据，预测增强子、候选上游转录因子和靶基因。scREG定义顺式调控潜力并用于降维和亚群特异性网络构建。FigR识别调控染色质结构域（DORCs）并推断GRN。DIRECT-NET使用梯度提升识别全基因组顺式调控元件及其靶基因。MICA使用互信息处理少数细胞的情况。
第二类使用深度整合和图学习。LINGER整合大规模外部批量数据和转录因子基序先验，推断GRN并估计转录因子活性。scMultiomeGRN构建模态特异性邻居聚合器和跨模态注意力模块。DeepMAPS将单细胞多组学建模为异构图并使用多头图变换器。GLUE通过图链接统一嵌入支持大规模整合。ScReNI使用最近邻和改良随机森林推断单细胞特异性网络。DeepRIG使用图自编码器学习全局调控结构。scSAGRN将空间关联纳入多组学网络推断。
第三类处理动态和细胞状态特异性。Dictys结合多组学足迹分析、随机过程网络和概率模型推断动态GRN。inferCSN使用拟时序重排细胞并构建细胞类型和状态特异性网络。GeneLink从单细胞转录组推断细胞类型特异性GRN。scTIGER使用基于注意力的卷积网络检测条件特异性网络重连。Inferelator 3.0可扩展到数百万细胞。
第四类通过虚拟扰动产生候选因果假设。CellOracle从配对多组学数据推断GRN并执行计算机模拟转录因子扰动。Pando整合多组学和转录因子结合位点预测，并使用混合遗传扰动验证调节因子。GenKI和scTenifoldKnk分别使用变分图自编码器和流形对齐进行虚拟敲除。scPRAM通过注意力机制预测未见细胞类型的扰动响应。此外，scMEGA执行端到端增强子GRN推断，STREAM使用Steiner森林框架推断增强子驱动的GRN，scMTNI使用多任务学习推断谱系特异GRN。
方法选择应基于可用数据和问题。评价GRN方法需区分边恢复性能与下游生物学效用，使用AUROC、AUPRC、早期精确率等指标，并报告标签覆盖率和可观察指标上限。统计关联、方向性预测、计算机模拟扰动和实验支持因果调控四个术语含义不同，应明确区分。
**4 细胞状态特异性GRN在癌症中的应用**
上皮-间质转化（EMT）是肿瘤细胞状态可塑性的典型例子。在小鼠皮肤鳞状细胞癌模型中，配对scRNA-seq和scATAC-seq描绘了不同EMT状态的转录组和染色质谱，CRISPR/Cas9实验表明Klf5和Pitx1控制早期EMT并是转移所必需，而Nfatc1和Creb3l1在后期起作用。在黑色素瘤中，基于调控网络的定量状态图揭示了多种耐药途径，计算机模拟扰动识别了减少耐药状态占据的联合策略。耐药和可塑性是临床重要应用。在患者来源的胶质瘤干细胞样细胞中，GRN拓扑决定耐药或敏感细胞在药物处理下是否通过不同的中间状态，模拟指导siRNA或联合治疗。黑色素瘤中TCF4依赖的GRN赋予免疫治疗耐药。实验方面，Spear-ATAC结合混合CRISPR敲低与单细胞染色质可及性，CAT-ATAC在同一细胞中捕获转录组、染色质可及性和sgRNA身份。配对多组学还优化了肿瘤亚型和谱系定义。结直肠癌中整合分析确定了两种上皮肿瘤细胞状态并细化共识分子分类。肝细胞癌中细胞命运推断结合SCENIC识别免疫激活、代谢和增殖终末状态，增殖状态特征与较差总生存相关。白血病、肺腺癌、肾透明细胞癌、前列腺癌、胃癌等研究也揭示了细胞状态特异调控程序。肿瘤微环境中，三阴性乳腺癌癌症相关成纤维细胞中的肌成纤维-炎症程序也由协调的调控网络维持。证据强度各异：有些研究有CRISPR功能验证，有些仍是临床前或回顾性证据。
**5 从预测到验证：解释与因果验证**
实用工作流程将网络推断、计算机模拟扰动和实验验证联系起来。CellOracle、Pando、GenKI和scTenifoldKnk生成计算机模拟扰动候选，Spear-ATAC和CAT-ATAC提供单细胞扰动读值。该循环已在胶质母细胞瘤、黑色素瘤和前列腺癌类器官中发现调控依赖关系。验证结果需谨慎解释：扰动实验检验特定情境下的基因功能，GRN边预测该情境中的关系，一致性强化边，不一致可能反映网络、扰动设计或细胞状态本身。基础模型为GRN推断带来新能力和解释性问题。GET学习跨胎儿和成人细胞转录组的调控语法。EpiAgent支持顺式调控元件的计算机模拟敲除。RegFormer将GRN先验嵌入Mamba架构，改善扰动反应和药物反应预测。ChromBERT从ChIP-seq谱中学习可解释的上下文特异性调控网络表示。然而，注意力导出的边评分可能仅增加很少的信息，模型内部特征关系不等于生物学因果。基础模型应作为假设生成器而非因果证据，需与常规图方法、生成方法和共表达基线比较，并用扰动实验验证。
**6 争议、挑战、局限与未来方向**
核心未决问题是因果关系：大多数GRN方法推断统计关联而非调控关系，方向性、反馈回路和增强子-启动子因果关系仍需扰动实验。评价标准尚未统一，方法积累速度快于基准测试，参考网络、预处理流程和指标的差异使跨研究比较困难。临床转化受限于配对临床样本稀缺、批次效应、肿瘤纯度以及深度学习解释技术尚不成熟。未来进展需要四个方向的协同：多模态扩展（加入DNA甲基化、组蛋白修饰、空间位置和时间动态）、因果AI（结合基础模型、虚拟扰动和高通量CRISPR筛选）、统一基准（覆盖肿瘤类型、平台和扰动，明确处理标签缺失和指标上限）以及临床转化（将细胞状态特异性GRN映射到药物反应、免疫治疗疗效和联合靶向）。挑战分为两类：一类可通过更好的方法和报告直接解决，如三维增强子-启动子环、不确定性量化、可重复性、代码可用性、超参数敏感性、阴性对照和基准设计；另一类反映更广泛的生物和临床复杂性，如肿瘤纯度、免疫和基质组成、空间组织、克隆结构、治疗史、细胞周期状态和批次效应。本综述是叙述性迷你综述，存在文献检索不全面、未进行定量荟萃分析等局限。
**7 结论**
配对单细胞转录组和染色质可及性数据提供了调控元件与转录输出之间的同细胞对应关系，AI和计算方法为从稀疏高维数据中学习细胞状态特异性网络提供了核心工具。SCENIC+、scMEGA、STREAM、scMTNI、LINGER、scMultiomeGRN、DeepMAPS和Dictys展示了多组学整合的方法价值，而CellOracle、Pando、Spear-ATAC和CAT-ATAC将网络预测与实验验证联系起来。在EMT、耐药、谱系可塑性和亚型分析中的应用表明，GRN可以从描述性图谱转变为可检验模型。下一步不是更多架构，而是共享基准、更强的因果验证和可解释、可验证的模型。
