Hupehenine在糖尿病模拟结直肠癌模型中抑制肿瘤细胞表型并调节巨噬细胞标记物谱

《Frontiers in Pharmacology》：Hupehenine suppresses tumor cell phenotypes and modulates macrophage marker profiles in a diabeticmimetic colorectal cancer model

　　

专业术语翻译摘要：
背景：糖尿病与结直肠癌（colorectal cancer, CRC）风险增加及死亡率升高相关，但其分子联系仍未完全阐明。研究人员旨在表征糖尿病与CRC共有的分子特征，并鉴定能够调控该界面候选轴的化合物。
方法：通过整合生物信息学及蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析鉴定疾病相关共有基因，随后分析TCGA及单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据。采用基于深度学习（DeepPurpose）和基于结构（AutoDock Vina）的虚拟筛选以优先排序多靶点配体。通过表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）和分子动力学模拟评估结合能力。在利用高糖、胰岛素和棕榈酸（三因素，three factors, TF）构建的糖尿病模拟模型中，以HCT116细胞和THP-1来源巨噬细胞评估细胞效应。
结果：IL1β-CXCL8-CXCR2轴被优先确定为糖尿病-CRC界面的候选炎症模块。TCGA和单细胞RNA-seq分析将轴相关表达与免疫浸润和巨噬细胞极化相关转录特征相关联；轴相关高表达亦与更长的总生存期相关。湖贝甲素（Hupehenine, HU），一种甾体生物碱，被鉴定为可结合IL1β、CXCL8和CXCR2的多靶点配体。SPR显示浓度依赖性结合（解离常数K_D：CXCR2，505 nM；CXCL8，2.2 μM；IL1β，12.7 μM）并干扰CXCL8-CXCR2结合。在糖尿病模拟模型中，HU降低了HCT116细胞的活力、迁移和侵袭。TF预处理细胞对HU的敏感性高于非TF细胞，而5-氟尿嘧啶或奥沙利铂未观察到相应的敏感性增加。HU还降低了M2相关并增加M1相关巨噬细胞标记物。
结论：这些发现支持IL1β-CXCL8-CXCR2轴作为糖尿病-CRC界面的候选免疫调节模块，并确定HU为一种体外多靶点配体。在糖尿病模拟条件下观察到的巨噬细胞标记物变化和差异性敏感性需进一步的机制和临床前评估，包括直接评估巨噬细胞功能。

论文解读：

研究背景与目的
糖尿病与结直肠癌（CRC）风险增加及死亡率升高密切相关，流行病学研究和孟德尔随机化证据均支持这一关联。然而，糖尿病相关代谢环境（包括高血糖、高胰岛素血症和慢性低度炎症）促进结直肠癌发生的分子机制仍不完全清楚。现有治疗策略并未专门针对这一疾病界面：二甲双胍等抗糖尿病药物的化学预防益处不一致，而5-氟尿嘧啶和奥沙利铂等常规化疗药物在糖尿病背景下的特异性获益亦未确立。慢性炎症被认为是糖尿病与癌症共同的病理机制。白细胞介素-1β（IL1β）作为上游促炎细胞因子可诱导下游趋化因子CXCL8（即IL-8）表达，CXCL8通过其受体CXCR2促进上皮-间质转化、招募免疫抑制性髓系细胞并维持肿瘤干细胞特性。因此，IL1β-CXCL8-CXCR2轴代表了代谢性炎症与肿瘤免疫交叉处的潜在治疗靶点。多靶点药物开发策略（多药理学）可能优于单靶点抑制。湖贝甲素（HU）是从湖北贝母中提取的甾体生物碱，已有研究显示其具有抗利什曼原虫和神经保护活性，但其在糖尿病-CRC界面作为多靶点调节剂的潜力尚未充分表征。本研究旨在通过生物信息学、虚拟筛选和细胞实验，系统鉴定糖尿病与CRC共有的分子特征，并评估HU对该候选轴的调控作用。

研究方法概述
研究人员整合了DisGeNET、TTD、GeneCards和OMIM四个疾病基因数据库，通过交集分析获得531个糖尿病和CRC共有基因，并进行GO/KEGG富集分析、STRING蛋白互作网络及CytoHubba多算法枢纽基因鉴定。利用TCGA-COAD/READ数据进行差异表达、生存分析和免疫浸润反卷积分析；使用已发表的CRC单细胞转录组图谱（GSE178341，62例患者371,223个细胞）进行细胞亚群注释和巨噬细胞极化评分。虚拟筛选采用DeepPurpose深度学习和AutoDock Vina结构-based方法，结合分子对接（AutoDock4）、100 ns分子动力学模拟（GROMACS）和MM/GBSA自由能计算。表面等离子体共振（SPR）验证结合动力学。细胞实验采用HCT116、SW480及正常结肠上皮细胞HCEC-1CT，以高糖（25 mM）、胰岛素（100 nM）和棕榈酸（200 μM）构成“三因素”（TF）糖尿病模拟条件，并利用THP-1来源巨噬细胞评估标记物变化。

研究结果
3.1 糖尿病与CRC共享的炎症基因模块：四数据库交集分析鉴定出531个共有基因，GO富集显示这些基因主要参与炎症反应调控、定位在质膜外侧，KEGG通路富集于PI3K/AKT信号通路、癌症中的microRNA及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路。PPI网络多算法分析确定了8个核心枢纽基因：IL1Β、TNF、NFKB1、TLR4、IL6、CXCL8、IFNG和IL10，表明慢性炎症是糖尿病与CRC的分子联系。
3.2 IL1β-CXCL8-CXCR2轴表达与免疫特征及更长总生存期相关：TCGA分析显示只有IL1Β和CXCL8在肿瘤中显著上调，且高表达与更长总生存期相关；CXCR2同样上调并与二者共表达。联合14个糖尿病相关基因表达特征评分后，三基因高共表达与更长总生存期相关，尤其在糖尿病相关高评分亚组中。免疫反卷积显示高轴表达亚组具有CD8+ T细胞浸润评分升高和高M2/M1巨噬细胞比率。单细胞分析显示IL1Β和CXCL8主要由髓系细胞表达，CXCR2主要在粒细胞上检测到；CXCL8表达髓系细胞比例与M2相关巨噬细胞转录评分（r=0.667，P<0.001）及M1相关评分（r=0.557，P<0.001）正相关；错配修复缺陷（MMRd）肿瘤较错配修复正常（MMRp）肿瘤具有更高的CD8+ T细胞耗竭相关评分和M2相关巨噬细胞评分。
3.3 虚拟筛选鉴定HU为IL1β-CXCL8-CXCR2轴的多靶点配体：DeepPurpose和AutoDock Vina交叉筛选的共识命中物中，HU预测得分最高。AutoDock4分子对接预测HU与IL1β、CXCL8和CXCR2的对接分数分别为-5.75±0.06、-6.44±0.20和-7.49±0.32 kcal/mol，CXCR2对接最有利。
3.4 生物物理分析支持HU多靶点结合并干扰CXCL8-CXCR2结合：100 ns分子动力学模拟显示HU与CXCR2保持连续结合，与CXCL8约91 ns后解离，与IL1β约53 ns起反复解离；蛋白骨架RMSD<0.39 nm；MM/GBSA自由能CXCR2为-18.9±2.6 kcal/mol，CXCL8为-6.3±1.6 kcal/mol，IL1β为-3.5±1.9 kcal/mol。SPR测量显示HU与CXCR2结合亲和力最强（K_D=505.3±4.6 nM），CXCL8为2.2±0.1 μM，IL1β为12.7±1.0 μM。IL1β和CXCL8自身与CXCR2的K_D分别为16.2±0.76 nM和1.5±0.13 nM；用10 μM HU预饱和CXCR2表面可使二者后续结合的表观K_D移至微摩尔范围，表明HU干扰CXCL8-CXCR2结合。
3.5 HU在糖尿病模拟条件下对抗肿瘤相关表型：HCT116细胞经TF处理1-3周后，活力、迁移和侵袭均时间依赖性增强。HU可剂量依赖性抑制这些TF增强的表型。TF条件化细胞对HU的敏感性增加（IC₅₀=26.7±1.3 μM）显著高于非TF细胞（IC₅₀=72.2±3.6 μM）；但TF条件化并未增加对5-氟尿嘧啶（IC₅₀ 31.2 vs 30.2 μM）或奥沙利铂（IC₅₀ 5.2 vs 4.5 μM）的敏感性。HU在浓度≤200 μM时对非致瘤性结肠上皮细胞HCEC-1CT的活力无显著影响。
3.6 HU调节轴相关信号并干扰CXCL8-CXCR2结合：TF上调NF-κB p65、IL1β、CXCL8、CXCR2及下游PI3K/AKT/mTOR信号和分泌型IL1β、CXCL8。HU选择性降低CXCL8 mRNA和分泌水平，同时减弱下游通路读数，但对NF-κB p65、IL1β和CXCR2总蛋白水平影响不大。IL1Β敲低模拟了HU对CXCL8和下游信号的部分效应；HU在外源IL1β存在下仍有效，且预先孵育IL1β与HU可抑制IL1β诱导的反应。CXCL8或CXCR2敲低抑制PI3K/AKT/mTOR信号，HU可降低外源CXCL8或CXCR2过表达驱动的信号。免疫共沉淀显示HU破坏CXCL8与CXCR2的物理相互作用。NF-κB p65过表达驱动的细胞增殖和迁移被HU减弱，而PI3K/AKT过表达可大部分绕过HU的抑制。单浓度比较显示HU（30 μM）将HCT116活力降至26%±1.5%，显著强于navarixin单用（54%±2.2%）和anakinra单用（62%±1.9%），与navarixin+anakinra联合（31%±2.3%）相近。
3.7 HU降低M2相关并增加M1相关巨噬细胞标记物：TF暴露的HCT116条件培养基增加THP-1来源巨噬细胞中M2相关标记物（CD206、IL10、TGFB、ARG1）并降低M1相关标记物（CD86、TNF、IL1Β、IL6）。无论在HCT116培养期间加入HU（TF+HU）还是直接加入巨噬细胞培养（TF暴露+HU），HU均显著降低M2相关标记物并升高M1相关标记物。外源IL1β+CXCL8刺激同样增加M2相关标记物，HU可逆转该效应。

讨论与结论
本研究表明IL1β-CXCL8-CXCR2轴是糖尿病与CRC界面处的候选免疫调节模块，HU作为天然多靶点配体可在体外结合三个靶点蛋白，其中对CXCR2亲和力最强，并干扰CXCL8-CXCR2结合。在糖尿病模拟模型中，HU抑制肿瘤细胞活力和运动能力，并将巨噬细胞标记物谱从M2样转向M1样。讨论部分指出，高轴表达与更长总生存期的关联可能反映一种免疫浸润但同时表达抑制性标志物的微环境，其机制尚需多变量调整和独立验证。HU与单靶点抑制剂相比在单浓度比较中表现出更强活性，支持多靶点策略的合理性，但因果贡献尚未确立。研究局限性包括：糖尿病模拟模型无法完全模拟体内糖尿病宿主复杂性；巨噬细胞标记物变化不能确立功能性极化；耗竭相关转录评分不等同于T细胞功能障碍；计算推断的细胞通讯不证明功能性信号传导；糖尿病相关表达特征需临床糖尿病状态验证；HU的药代动力学、口服生物利用度和完整靶点谱尚未表征。结论：该研究优先确定IL1β-CXCL8-CXCR2轴为糖尿病-CRC界面的候选免疫调节模块，HU在体外结合三种蛋白、干扰CXCL8-CXCR2结合、降低肿瘤细胞活力与运动能力并调节巨噬细胞标记物。未来研究应聚焦巨噬细胞功能、体内疗效、靶点选择性和药代动力学评估。