IGF2BP1敲低与神经母细胞瘤细胞中转录因子基因的可变剪接变化相关联

《Frontiers in Oncology》：IGF2BP1 knockdown associates with alternative splicing changes of transcription factor genes in neuroblastoma cells

　　

背景：IGF2BP1是一种癌胚RNA结合蛋白（RNA-binding protein, RBP），在神经母细胞瘤中具有致癌功能，但IGF2BP1敲低是否与转录因子（transcription factor, TF）基因的可变剪接（alternative splicing, AS）变化相关尚不清楚。 方法：研究人员重新分析了来自IGF2BP1敲低的BE(2)-C细胞的RNA-seq数据（三个敲低样本和三个对照样本）。鉴定了差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）和AS事件（alternative splicing events, ASEs），随后进行了GO/KEGG富集分析。将差异剪接基因与人类TF列表取交集。在对照和IGF2BP1敲低的BE(2)-C细胞中进行异构体特异性qRT-PCR以验证百分比剪接指数（percent spliced in, PSI）变化。使用RIP-qPCR检测IGF2BP1与候选TF mRNA的结合。分析了来自HepG2和K562细胞的ENCODE eCLIP-seq数据作为间接支持证据。 结果：研究人员鉴定出807个DEGs和3,053个显著ASEs。在具有显著剪接变化的基因中，64个被注释为TFs；经过严格过滤后，对应18个基因的20个剪接事件得以保留。独立的qRT-PCR验证了LMO4（A5SS）、TCF7L2（盒式外显子）和EHMT2（外显子跳跃）的PSI变化，这些变化与RNA-seq预测一致。RIP-qPCR证实IGF2BP1在细胞内结合LMO4、TCF7L2和EHMT2 mRNA，但不结合NCOR2。来自非神经母细胞瘤细胞系的eCLIP-seq数据提供了间接支持证据。 结论：IGF2BP1敲低与神经母细胞瘤细胞中TF基因广泛的AS变化相关，并且IGF2BP1结合LMO4、TCF7L2和EHMT2 mRNA。这些发现为未来的机制研究提供了相关性资源和假设；直接的因果关系仍有待建立。

研究背景与科学问题

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体肿瘤，其临床异质性显著，从自发消退到侵袭性进展不等。尽管采用强化多模式治疗，高危患者的生存率仍低于40%。与成人肿瘤相比，神经母细胞瘤基因突变较少，但存在广泛的染色体畸变和表观遗传异常。近年研究强调，由RNA结合蛋白（RBP）介导的转录后调控失调，尤其是可变剪接（AS），在肿瘤发生中发挥关键作用。转录因子（TF）是基因表达的核心调控者，其本身也受到多层次调控，约20%已知癌基因编码TF。然而，直接靶向TF的治疗手段仍然有限。IGF2BP1是一种癌胚RBP，作为m⁶A阅读器调控靶mRNA的稳定性、定位和翻译，在多种癌症中高表达并促进增殖、侵袭和化疗耐药。在神经母细胞瘤中，IGF2BP1表达与MYCN扩增及不良预后相关。但目前尚不清楚IGF2BP1敲低是否与神经母细胞瘤中TF基因的AS变化相关联。因此，研究人员开展本研究，系统探讨IGF2BP1敲低与神经母细胞瘤细胞中TF基因AS模式的关联。

主要技术方法

研究人员从GEO数据库获取原始RNA-seq数据集GSE161086，包含三例IGF2BP1敲低BE(2)-C细胞样本和三例对照样本。使用HISAT2进行序列比对，DESeq2进行差异表达分析，ABLAs软件检测和定量十种AS事件类型。利用TRRUST v2数据库的人类TF列表筛选差异剪接的TF基因。独立进行IGF2BP1敲低实验，通过qRT-PCR验证PSI变化，并通过RIP-qPCR检测IGF2BP1与候选TF mRNA的结合。此外，分析ENCODE数据库中HepG2和K562细胞的eCLIP-seq数据作为间接支持证据。

研究结果

IGF2BP1敲低重塑BE(2)-C细胞转录组，其表达与神经母细胞瘤进展相关

通过对GSE161086数据的再分析，样本聚类热图显示敲低组与对照组明显分离。共鉴定出807个DEGs，其中495个上调，312个下调。上调基因富集于神经元功能和细胞运动相关通路，下调基因富集于发育和代谢过程。TARGET神经母细胞瘤队列分析显示，IGF2BP1表达随肿瘤分期增加而显著升高。

IGF2BP1敲低与BE(2)-C细胞广泛的可变剪接变化相关

鉴定出3,053个显著差异ASEs，涵盖九种非内含子保留类型，其中外显子跳跃和互斥外显子最为常见。PCA分析显示敲低组与对照组基于PSI值可明确区分。差异剪接基因富集于细胞增殖和基因表达调控相关通路。值得注意的是，21个基因同时存在于差异剪接基因和DEGs中，包括HNRNPA1和SRSF3等已知剪接因子。

IGF2BP1敲低与转录因子的可变剪接变化相关

在差异剪接基因中，64个被注释为TF。经严格过滤后，对应18个基因的20个剪接事件被确定为可靠变化。重点关注的LMO4和TCF7L2在IGF2BP1敲低后表现出显著的PSI变化，IGV可视化确认了其剪接模式的改变。

独立qRT-PCR验证可变剪接变化

在独立进行的IGF2BP1敲低实验中，qRT-PCR验证了LMO4 A5SS近端5'剪接位点、TCF7L2替代外显子包含和EHMT2替代外显子包含的PSI均显著增加，方向与RNA-seq预测一致。

IGF2BP1在BE(2)-C细胞中结合LMO4、TCF7L2和EHMT2 mRNA

Western blot确认抗IGF2BP1抗体成功富集IGF2BP1蛋白。RIP-qPCR显示，抗IGF2BP1抗体显著富集LMO4、TCF7L2和EHMT2 mRNA，而对NCOR2无显著富集。

非神经母细胞瘤细胞系中的eCLIP-seq提供间接支持证据

ENCODE eCLIP-seq数据显示，在HepG2细胞中IGF2BP1在LMO4、TCF7L2和NCOR2基因座有显著结合峰；在K562细胞中，EHMT2被鉴定为结合的差异剪接TF。NCOR2在HepG2中结合但在BE(2)-C中不富集的差异提示细胞类型特异性的IGF2BP1结合。

讨论与结论

该研究重新分析了GSE161086数据集，重点关注TF基因的AS变化，提供了转录后调控的补充视角。研究表明IGF2BP1敲低伴随广泛的剪接事件变化，提示其可能参与更广泛的转录后调控。但需强调的是，该研究为相关性研究而非因果性研究。RIP-qPCR仅能证明结合，不能证明直接剪接调控。观察到的剪接变化可能是mRNA稳定性或翻译改变的继发效应，或由经典剪接因子表达变化间接介导。

关于潜在机制，目前只能提出少数未经验证的假说：IGF2BP1可能与其他RBP或剪接因子协同影响剪接体组装或剪接位点选择；可能结合前体mRNA竞争性影响可变外显子附近剪接因子的招募；或通过环状RNA等非编码RNA网络间接影响剪接。

四个候选TF在肿瘤发生中功能明确：LMO4参与神经元发育，其高表达与侵袭性IV期神经母细胞瘤相关；TCF7L2是Wnt通路效应分子；EHMT2是组蛋白甲基转移酶，其抑制可增强NK细胞抗肿瘤免疫；NCOR2作为表观遗传抑制因子参与神经母细胞瘤分化。

研究局限性包括：样本量小、未进行基因水平FDR校正、RIP-qPCR无法区分前体mRNA与成熟mRNA、eCLIP-seq数据来自非神经母细胞瘤细胞系、未在独立临床队列中验证剪接事件的临床意义。

研究结论： IGF2BP1敲低与神经母细胞瘤细胞中TF基因显著的AS变化相关，并鉴定出LMO4、TCF7L2、EHMT2和NCOR2为候选剪接相关TF。IGF2BP1在细胞内结合LMO4、TCF7L2和EHMT2 mRNA，支持IGF2BP1与转录后剪接模式的关联。然而，直接因果关系尚未证实。这些发现为未来机制研究提供了相关性资源和假说。