基于热敏性泊洛沙姆时间门控的RPA-CRISPR单管一步法猴痘病毒即时检测平台构建与验证

《Cellular & Molecular Biology Letters》：Development of a one-step RPA–CRISPR/Cas12a point-of-care detection platform based on poloxamer-mediated temporal-spatial separation strategy and its application in monkeypox virus POCT

【字体：大中小】 时间：2026年10月21日 来源：Cellular & Molecular Biology Letters 12.2

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　　摘要背景实时定量PCR（qPCR）是病原体检测的金标准，但其依赖于专业实验室条件，难以满足即时检测（POCT）的现场应用需求。CRISPR/Cas12a技术具有高特异性，但单独检测灵敏度有限，需要使用重组酶聚合酶扩增（RPA）进行预扩增。传统的两步法重组酶聚合酶扩增-成簇规律

摘要

背景

实时定量PCR（qPCR）是病原体检测的金标准，但其依赖于专业实验室条件，难以满足即时检测（POCT）的现场应用需求。CRISPR/Cas12a技术具有高特异性，但单独检测灵敏度有限，需要使用重组酶聚合酶扩增（RPA）进行预扩增。传统的两步法重组酶聚合酶扩增-成簇规律间隔短回文重复序列（RPA-CRISPR）方法易受气溶胶污染，而一步法系统（如SHERLOCKv2）则存在模板竞争问题，导致灵敏度降低10至100倍。为解决这些问题，本研究构建了ChronoGate RPA-CRISPR平台，利用热敏性泊洛沙姆实现扩增与检测的时间分离，从而建立了一种快速灵敏的即时检测方法。

方法

泊洛沙姆在低于25 °C的温度下包裹CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）/CRISPR RNA（crRNA）复合物，并在37 °C下以约8分钟的延迟释放，从而实现有序的"先扩增、后检测"反应。最佳反应条件确定为在15 μL体积中加入15%（w/v）泊洛沙姆。同时开发了一款配套的便携式荧光检测仪。以猴痘病毒（MPXV）F3L基因作为检测靶标，通过测试质粒DNA的系列稀释液和非靶标病原体来验证灵敏度和特异性，随后对临床样本进行了分析。

结果

该平台的包裹效率为85.7%，检测灵敏度为1拷贝/μL，与两步法相当。与非靶标病原体无交叉反应，证实了良好的特异性。在14个临床样本中，检测结果与qPCR完全一致，检测时间仅需40分钟，与qPCR相比速度提高了56%。

结论

ChronoGate RPA-CRISPR平台能够实现快速、灵敏、特异的单管一步法检测，操作简单且便携性高，为资源有限地区猴痘病毒及其他病原体的即时检测提供了可靠方案。

背景

实时定量PCR（qPCR）是病原体检测的金标准，但其依赖于专业实验室条件，难以满足即时检测（POCT）的现场应用需求。CRISPR/Cas12a技术具有高特异性，但单独检测灵敏度有限，需要使用重组酶聚合酶扩增（RPA）进行预扩增。传统的两步法重组酶聚合酶扩增-成簇规律间隔短回文重复序列（RPA-CRISPR）方法易受气溶胶污染，而一步法系统（如SHERLOCKv2）则存在模板竞争问题，导致灵敏度降低10至100倍。为解决这些问题，本研究构建了ChronoGate RPA-CRISPR平台，利用热敏性泊洛沙姆实现扩增与检测的时间分离，从而建立了一种快速灵敏的即时检测方法。

方法

泊洛沙姆在低于25 °C的温度下包裹CRISPR相关蛋白12a（Cas12a）/CRISPR RNA（crRNA）复合物，并在37 °C下以约8分钟的延迟释放，从而实现有序的"先扩增、后检测"反应。最佳反应条件确定为在15 μL体积中加入15%（w/v）泊洛沙姆。同时开发了一款配套的便携式荧光检测仪。以猴痘病毒（MPXV）F3L基因作为检测靶标，通过测试质粒DNA的系列稀释液和非靶标病原体来验证灵敏度和特异性，随后对临床样本进行了分析。