sgp130Fc阻断IL-6 trans-signaling可减轻苯扎氯铵诱导的人角膜上皮细胞炎症、氧化失衡、内质网应激和屏障破坏

《Eye and Vision》：Blocking IL-6 trans-signaling mitigates benzalkonium chloride-induced inflammation, oxidative imbalance, ER stress, and barrier disruption in human corneal epithelial cells

　　

背景：苯扎氯铵（benzalkonium chloride, BAC）是眼科制剂中常用防腐剂，可在角膜上皮细胞中引发促炎细胞因子反应和细胞毒性效应，导致与干眼病（dry eye disease, DED）相关的眼表损伤。白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）trans-signaling是已确立的促炎通路，参与内皮和上皮屏障功能障碍。因此，本研究探讨用sgp130Fc靶向抑制IL-6 trans-signaling是否可减轻BAC诱导的角膜上皮细胞细胞毒性损伤。

方法：人端粒酶永生化角膜上皮（human telomerase-immortalized corneal epithelial, hTCEpi）细胞暴露于0.001% BAC 30 min，在有或无10 μg/mL sgp130Fc条件下。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR）和蛋白质印迹（western blot）分析评估炎症、氧化失衡、内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激和上皮屏障破坏标志物。采用比色、荧光和发光法测定活性氧（reactive oxygen species, ROS）、抗氧化能力和细胞内钙流。采用细胞底物阻抗传感（electric cell-substrate impedance sensing, ECIS）评估上皮屏障功能。采用单因素方差分析（one-way analysis of variance, ANOVA）及Tukey’s或Holm-?ídák多重比较检验进行统计分析，P < 0.05视为具有统计学显著性。

结果：BAC暴露激活IL-6 trans-signaling，表现为sIL-6R/sgp130比值增加、膜结合IL-6受体（membrane-bound IL-6 receptor, mIL-6R）水平降低、糖蛋白130（glycoprotein 130, gp130）水平不变。BAC还增加分泌型IL6水平、IL6RA表达及下游炎症介质单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1, MCP1）和细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1, ICAM1），这些均被sgp130Fc减弱。BAC诱导的氧化失衡表现为ROS和过氧化氢（H₂O₂）产生增加、抗氧化酶减少和总抗氧化能力降低，而sgp130Fc减轻这些效应。此外，BAC增加细胞内钙（Ca²⁺）水平和ER应激标志物，包括热休克蛋白72（heat shock protein 72, HSP72）、结合免疫球蛋白蛋白（binding immunoglobulin protein, BiP）、蛋白激酶RNA样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK）和内质网氧化还原酶1α（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1 alpha, Ero1α），并损害上皮屏障功能，表现为跨上皮电阻（trans-epithelial electrical resistance, TER）降低及β-catenin、occludin和claudin-1水平降低。sgp130Fc减轻细胞内钙升高，部分缓解ER应激反应，并保留上皮屏障完整性和连接蛋白水平。

结论：这些发现表明IL-6 trans-signaling参与BAC诱导的角膜上皮损伤，提示靶向该通路可能对DED及相关眼表炎症性疾病具有治疗潜力。

研究背景与问题：干眼病（dry eye disease, DED）是一种多因素疾病，以泪膜不稳定和眼表稳态丧失为特征。其核心环节之一是角膜上皮屏障破坏；该屏障由紧密连接和黏附连接等细胞间连接复合体维持，可保护眼表、维持泪膜稳定性并调节炎症信号。眼表应激时，慢性炎症破坏屏障相关蛋白，活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生过多和抗氧化防御受损进一步损害上皮完整性，形成眼表炎症、氧化损伤和上皮功能障碍的自我维持循环。苯扎氯铵（benzalkonium chloride, BAC）因广谱抗菌和表面活性剂特性广泛用于眼科制剂，但长期暴露与眼表毒性相关，可诱导上皮损伤、炎症激活、氧化损伤和屏障功能受损，从而促进或加重DED。临床研究显示停用含BAC药物可改善干眼症状和眼表染色。BAC作为阳离子表面活性剂，可破坏细胞膜、增加膜通透性并削弱角膜上皮屏障。然而，连接BAC诱导上皮损伤与下游炎症及氧化还原反应的信号通路仍未完全明确。白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）是促炎细胞因子，DED患者泪液中IL-6升高，BAC可刺激角膜上皮细胞产生IL-6。细胞应激还可诱导IL-6和可溶性IL-6受体（soluble IL-6 receptor, sIL-6R）产生。IL-6信号包括cis-、trans-和cluster信号；cis-signaling通过膜结合IL-6受体（membrane-bound IL-6 receptor, mIL-6R）通常与稳态、抗炎和细胞保护相关，而IL-6 trans-signaling利用sIL-6R驱动促炎反应，糖蛋白130（glycoprotein 130, gp130）是两种通路信号转导所需的共受体。sgp130是天然IL-6 trans-signaling抑制剂，sgp130Fc由可溶性gp130与人免疫球蛋白G1 Fc段融合而成，低浓度时优先抑制IL-6 trans-signaling而不影响cis-signaling。研究人员此前已显示sgp130Fc在视网膜内皮细胞中可保护免受炎症、氧化应激、线粒体功能障碍、屏障破坏和凋亡。因此，本研究探讨选择性抑制IL-6 trans-signaling是否可减轻BAC诱导的炎症激活、氧化失衡、内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激和上皮屏障功能障碍，并得出IL-6 trans-signaling可能参与BAC诱导角膜上皮损伤的结论，提示靶向该通路对DED及相关眼表炎症性疾病具有潜在治疗意义。

关键技术方法概述：研究采用人端粒酶永生化角膜上皮（human telomerase-immortalized corneal epithelial, hTCEpi）细胞系，无临床样本队列。细胞以0.001% BAC处理30 min，并以10 μg/mL sgp130Fc预处理2 h。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测IL6、IL6RA、MCP1、ICAM1及抗氧化酶基因表达；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测条件培养基sIL-6R、sgp130和IL-6；蛋白质印迹（western blot）检测mIL-6R、gp130、过氧化物还原酶（peroxiredoxin, PRDX）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、BiP、PERK、Ero1α、β-catenin、occludin和claudin-1等蛋白；采用DCFDA和ROS-Glo检测总ROS和H₂O₂，抗氧化能力试剂盒检测总抗氧化能力，Fluo-3 AM检测细胞内钙流，细胞底物阻抗传感（ECIS）检测跨上皮电阻（TER）。统计采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey’s或Holm-?ídák多重比较检验，P < 0.05为显著。

研究结果：

1. BAC暴露激活hTCEpi细胞中IL-6 trans-signaling及下游炎症反应。通过ELISA、RT-PCR和western blot检测，BAC暴露显著增加条件培养基中sIL-6R/sgp130比值和分泌型IL-6水平，降低细胞内mIL-6R水平，而gp130水平不变；BAC增加IL6和IL6RA表达，并上调下游炎症介质MCP1和ICAM1，sgp130Fc预处理可减弱这些反应。

2. sgp130Fc处理减轻BAC诱导的hTCEpi细胞氧化失衡。通过ROS和H₂O₂检测及抗氧化指标分析，BAC增加总ROS和H₂O₂，降低SOD1、PRDX1、PRDX2、GPX1、GPX4和TXN表达以及总PRDX和CAT蛋白水平，并显著损害总抗氧化能力；sgp130Fc预处理可减轻或阻止这些变化，提示抑制IL-6 trans-signaling有助于保留抗氧化防御。

3. 抑制IL-6 trans-signaling可保护BAC处理的hTCEpi细胞免受钙流和ER应激。通过细胞内钙检测和western blot分析，BAC增加细胞内Ca²⁺水平及HSP72、BiP、PERK和Ero1α等ER应激标志物；sgp130Fc预处理可减轻Ca²⁺升高，并部分缓解ER应激反应。

4. sgp130Fc部分预防BAC诱导的角膜上皮屏障功能障碍。通过ECIS和western blot检测，BAC暴露60 min后引起TER降低，并降低β-catenin、occludin和claudin-1水平；sgp130Fc预处理可部分恢复TER并部分防止连接蛋白丢失，表明BAC损害角膜上皮屏障完整性，而选择性抑制IL-6 trans-signaling可部分保留屏障功能。

讨论部分总结：DED中泪膜不稳定和高渗触发细胞应激，促进促炎细胞因子产生。DED患者泪液和结膜上皮中IL-6升高，并与症状严重程度及眼表参数相关；DED泪液还含有升高的sIL-6R，提示IL-6/受体相互作用可作为治疗靶点。BAC常用浓度约为0.004%至0.02%，除杀菌外可增加上皮通透性和药物渗透，但长期使用与干眼相关。0.001% BAC短期暴露足以诱导体外角膜上皮功能障碍，并维持足够细胞活力，因此作为亚细胞毒性但具有生物学相关性的损伤模型。本研究中BAC增加sIL-6R/sgp130比值，提示增强IL-6 trans-signaling；sIL-6R相对内源性抑制剂sgp130增加，可能增强IL-6/sIL-6R复合物激活gp130表达细胞的能力，促进促炎信号。此前研究显示IL-6 trans-signaling介导视网膜内皮细胞炎症和氧化应激，ICAM-1和MCP-1在IL-6 trans-signaling激活后上调；ICAM-1在DED中局部和系统升高，lifitegrast通过阻断淋巴细胞功能相关抗原-1与ICAM-1相互作用发挥治疗作用，MCP-1则调节单核细胞募集并在高渗应激下于hTCEpi细胞中明显升高。氧化应激是DED进展中心环节，DED结膜上皮中SOD、GPX和CAT蛋白水平显著降低且与症状严重程度相关。本研究中BAC轻度增加总ROS和H₂O₂产生，但显著降低关键抗氧化酶表达和总抗氧化能力，提示BAC诱导的氧化失衡主要反映抗氧化防御受损。sgp130Fc预处理减弱这些效应，提示IL-6 trans-signaling部分参与BAC诱导的氧化损伤。讨论还涉及脂质过氧化、ER应激和未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）：高渗和IL-6信号可通过PERK诱导ER应激，严重ER应激时PERK可增加C/EBP同源蛋白，后者调节Ero1α，Ero1α促进氧化蛋白折叠并产生H₂O₂，而PRDX4调节ER内H₂O₂。本研究中BAC处理hTCEpi细胞显示Ero1α升高和总PRDX降低，提示ER氧化还原稳态受损；BiP和HSP72等伴侣蛋白升高，支持UPR信号参与BAC诱导的细胞毒性。钙是调节ER稳态的关键信号分子，ER应激促进Ca²⁺释放，而过度Ca²⁺内流也可触发ER应激；IL-6暴露与ER应激增加和Ca²⁺储存减少相关，高渗DED模型也显示角膜上皮细胞内Ca²⁺增加。sgp130Fc减轻BAC诱导的BiP、PERK、Ero1α和细胞内Ca²⁺升高，提示阻断IL-6 trans-signaling可部分缓解ER应激及Ca²⁺失调。关于屏障，角膜上皮屏障提供物理和免疫保护，紧密连接调节旁细胞通透性，黏附连接促进紧密连接形成并提供结构支持，屏障功能依赖Ca²⁺稳态。BAC剂量依赖地破坏角膜上皮屏障；在临界胶束浓度约0.01%至0.02%或以上时，BAC可通过表面活性剂特性直接溶解细胞膜；在亚临界胶束浓度下，则可能通过炎症信号和氧化损伤导致更渐进的膜失稳。TER在低至0.0001% BAC时即可下降，并在接近0.01% BAC时出现饱和效应；BAC还可诱导浓度依赖性漏电流，提示屏障受损和离子通透性增加。炎症和氧化通路可放大BAC诱导的屏障破坏；IL-6暴露可降低角膜上皮细胞TER并改变连接蛋白水平，ROS积累可通过加重炎症损伤和直接损伤连接蛋白增加上皮旁细胞通透性。总体而言，sgp130Fc选择性抑制IL-6 trans-signaling可减弱BAC诱导的多种损伤反应，包括炎症激活、氧化失衡、ER应激、钙失调和上皮屏障破坏。研究局限包括：0.001% BAC处理30 min后hTCEpi细胞IL-6分泌较轻微，与这些细胞分泌反应有限一致；TER和连接蛋白部分恢复提示IL-6非依赖机制，如BAC直接表面活性剂效应和其他应激通路，也参与BAC诱导损伤；BAC诱导IL-6分泌的动力学及在额外炎症或慢性应激条件下的可重复性需进一步研究；在BAC暴露期间或之后给予sgp130Fc可能具有进一步治疗相关性；角膜上皮细胞表达Fc受体，未来研究应包括sgp130Fc单独和Fc对照以排除Fc介导效应；BAC暴露虽重现DED相关炎症信号和上皮屏障破坏等特征，但不能完全复现DED复杂病理，因此应在BAC诱导上皮损伤相关眼表功能障碍背景下解释。

研究结论翻译：这些发现提示BAC暴露激活hTCEpi细胞中促炎IL-6 trans-signaling。sgp130Fc选择性抑制IL-6 trans-signaling可减轻炎症、氧化和应激反应，同时部分保留上皮屏障功能。靶向该通路可能代表减少眼表炎症和改善DED结局的治疗策略。