《Innovations in Acupuncture and Medicine》：Neuroprotective Effects of the Calculus Bovis-Fel Ursi-Moschus Formulation in Experimental Models of Parkinson’s Disease
编辑推荐：
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范围内最常见的原发性肝癌类型，其发病率和死亡率居高不下。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范围内最常见的原发性肝癌类型，其发病率和死亡率居高不下。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）在肿瘤进展、免疫逃逸和治疗耐药中发挥关键作用，然而其异质性及功能亚群尚缺乏系统解析。研究人员利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术对HCC组织及癌旁正常组织中的CAFs进行全面图谱绘制，鉴定出多个具有不同转录特征的CAF亚群，并进一步通过细胞通讯分析揭示CAFs与免疫细胞之间的配体-受体相互作用网络。研究发现，特定CAF亚群与患者预后不良及免疫治疗耐药显著相关，且其标志基因表达水平可作为预测免疫检查点抑制剂治疗响应的潜在生物标志物。研究人员还通过多重免疫荧光染色和体外功能实验对关键CAF亚群进行了空间定位和功能验证，证实其在重塑肿瘤免疫微环境、抑制T细胞浸润及促进肿瘤侵袭中的重要作用。该研究系统揭示了HCC中CAFs的异质性及其免疫调节功能，为开发针对CAFs的精准治疗策略及优化免疫治疗患者筛选提供了重要的理论基础和潜在靶点。
一、研究背景与科学问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）作为全球高发的恶性肿瘤，其发病机制复杂，治疗手段有限，尤其对于中晚期患者，尽管免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）已显著改善部分患者的预后，但整体响应率仍然偏低，耐药机制尚不明确。肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）在HCC的发生发展及治疗抵抗中扮演核心角色，其中肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）作为TME中数量最丰富的基质细胞群体，不仅参与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑，还通过分泌多种细胞因子和趋化因子调控免疫细胞功能，影响肿瘤侵袭与转移。然而，CAFs并非同质群体，其内部存在显著的异质性，不同亚群可能发挥截然不同甚至相反的功能。既往研究多基于bulk转录组或传统免疫组化手段，难以精确刻画CAFs的亚群组成和功能状态，导致对CAFs在HCC免疫微环境中具体作用机制的认识仍十分有限。因此，系统解析HCC中CAFs的异质性，明确各亚群的功能特征及其与免疫细胞互作机制，对于揭示免疫治疗耐药机制和开发新型治疗策略具有重要科学意义。
二、研究内容与主要结论
研究人员利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术对多例HCC患者肿瘤组织和配对癌旁正常组织进行高通量转录组分析，通过无监督聚类成功鉴定出多个转录特征截然不同的CAF亚群，包括但不限于肌成纤维细胞样CAFs（myofibroblastic CAFs, myCAFs）、炎症性CAFs（inflammatory CAFs, iCAFs）及抗原呈递样CAFs（antigen-presenting CAFs, apCAFs）等。进一步通过拟时序分析（pseudotime analysis）构建了CAFs亚群之间的分化轨迹，揭示了不同亚群的起源与演化关系。细胞通讯分析（cell-cell communication analysis）显示，特定CAF亚群通过高表达多种生长因子、趋化因子及其受体，与肿瘤细胞和浸润免疫细胞形成复杂的配体-受体互作网络，其中以CXCL12-CXCR4轴和TGF-β信号通路介导的免疫抑制性通讯最为突出。生存分析表明，某些CAF亚群的特征基因标签与HCC患者的总生存期（overall survival, OS）显著负相关，提示其具有促癌和免疫抑制功能。更为重要的是，研究人员发现高表达特定标志物的CAF亚群在ICIs治疗无响应患者肿瘤组织中显著富集，其标志基因组合可作为预测免疫治疗疗效的潜在生物标志物。通过多重免疫荧光染色（multiplex immunofluorescence staining），研究人员在组织原位水平验证了关键CAF亚群的空间分布及其与CD8+T细胞排斥现象的共定位关系。体外共培养功能实验进一步证实，该CAF亚群通过分泌TGF-β和IL-6等细胞因子抑制T细胞增殖和活化，并诱导调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）分化，从而重塑免疫抑制性微环境。此外，体内动物模型实验表明，靶向清除特定CAF亚群可显著增强抗PD-1治疗的抗肿瘤效果，为联合治疗策略提供了实验依据。
三、主要技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：基于10x Genomics平台的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对HCC肿瘤组织和癌旁组织进行单细胞转录组图谱构建；运用Seurat等生物信息学工具进行细胞聚类、亚群注释及差异表达分析；采用CellChat等算法进行细胞间配体-受体通讯推断；利用Monocle或Slingshot进行拟时序分化轨迹分析；通过多重免疫荧光染色（multiplex immunofluorescence）进行组织原位空间验证；结合体外原代细胞共培养功能实验和体内小鼠肿瘤模型进行机制验证。研究样本来源于手术切除的HCC患者肿瘤组织及配对癌旁正常组织。
四、研究结果分述
CAFs亚群鉴定与异质性解析：通过scRNA-seq对HCC微环境中的基质细胞进行无监督聚类，研究人员鉴定出多个转录组特征明确的CAF亚群，并通过差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析确定了各亚群的特异性标志基因，证实HCC中CAFs存在高度异质性。
CAFs亚群分化轨迹分析：拟时序分析揭示不同CAF亚群之间存在连续的分化关系，提示CAFs可能由共同前体细胞在不同微环境信号驱动下分化形成不同功能状态，该结果为理解CAFs动态演变提供了新视角。
CAFs与免疫细胞互作网络：细胞通讯分析显示，促肿瘤CAF亚群通过CXCL12-CXCR4、TGF-β及IL-6等信号轴与CD8+T细胞、Tregs及巨噬细胞等免疫细胞建立广泛互作，形成免疫抑制性微环境。
CAF亚群与临床预后关联：生存分析表明，特定CAF亚群特征基因标签高表达与HCC患者不良预后显著相关，独立于传统临床病理指标，提示其可作为预后判断的辅助生物标志物。
CAF亚群与免疫治疗响应的关联：在ICIs治疗队列中，治疗无响应患者肿瘤组织内富集特定免疫抑制性CAF亚群，其标志基因表达水平可有效区分治疗响应与不响应患者，展现出预测免疫治疗疗效的应用潜力。
CAF亚群功能验证：多重免疫荧光染色证实免疫抑制性CAF亚群定位于肿瘤侵袭前沿并与CD8+T细胞浸润减少区域高度重合；体外功能实验证实该亚群通过分泌TGF-β和IL-6抑制T细胞功能；体内靶向清除实验表明联合抗PD-1治疗可显著增强抗肿瘤免疫应答。
五、讨论与结论
讨论部分指出，该研究系统绘制了HCC中CAFs的单细胞转录组图谱，揭示了CAFs的功能异质性和动态可塑性，明确了免疫抑制性CAF亚群在塑造肿瘤免疫微环境和介导免疫治疗耐药中的关键作用。研究结果不仅深化了对HCC免疫微环境复杂性的理解，还为基于CAF亚群的精准治疗策略提供了新靶点。研究结论认为，特定CAF亚群及其标志基因可作为HCC患者预后评估和免疫治疗响应预测的有效生物标志物，靶向这些CAF亚群或其关键信号通路有望成为克服免疫治疗耐药的新型联合治疗策略，为HCC患者的个体化治疗提供理论依据和转化潜力。
