低剂量histrelin诱导母马排卵：肌内注射与Bai-hui及Yan-chi穴位药物注射的部分随机交叉初步研究

《Veterinary Research Communications》：Low-dose histrelin for ovulation induction in mares: a partially randomized crossover pilot study

　　

这项部分随机交叉初步研究评估了降低剂量的histrelin用于母马排卵诱导，并比较了肌内注射（intramuscular, IM）给药与在Bai-hui和Yan-chi穴位进行药物穴位注射（pharmacopuncture）。共纳入11匹母马，其中9匹完成所有8个方案并纳入分析。方案包括250 μg histrelin IM（标准剂量）、75 μg IM、25 μg IM、无干预、Bai-hui生理盐水、Yan-chi生理盐水、Bai-hui 25 μg histrelin和Yan-chi 25 μg histrelin。通过经直肠超声检查（transrectal ultrasonography）在预定检查时评估排卵直至检测到排卵，以48 h内排卵为主要结局。首次在24 h检测到的排卵被排除出主要分析。48 h内排卵发生于88.9%（8/9）的250 μg IM观察、87.5%（7/8）的75 μg IM、87.5%（7/8）的25 μg IM、37.5%（3/8）的无干预、50.0%（3/6）的Bai-hui生理盐水、100%（9/9）的Bai-hui 25 μg histrelin、12.5%（1/8）的Yan-chi生理盐水以及87.5%（7/8）的Yan-chi 25 μg histrelin。精确95%置信区间（confidence intervals, CIs）较宽，反映样本量小。与无干预方案进行的探索性成对比较未进行多重比较校正，应谨慎解释。这些发现提供了初步证据，表明降低的histrelin剂量，包括25 μg，可在母马中于48 h内诱导排卵。然而，本研究未证明药物穴位注射较相同降低剂量的IM给药具有优势。需要更大规模、完全随机的研究来确认降低剂量histrelin的疗效，并确定在特定穴位给药是否提供任何额外效应。

研究背景：histrelin是一种合成促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone, GnRH）激动剂，可刺激垂体释放黄体生成素（luteinizing hormone, LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH），促进导致排卵的内分泌事件。在母马中，已有报道显示histrelin治疗后82–100%于48 h内排卵，250 μg IM为商业繁殖项目常用剂量。近期，75 μg histrelin在Bai-hui或Governing Vessel-1穴位给药与高比例48 h内排卵相关，提示更低剂量值得进一步研究。药物穴位注射（pharmacopuncture）是将药物给予至穴位，旨在结合药物药理作用与穴位刺激的生理效应，可能降低药物剂量并维持疗效，同时减少不良反应和治疗成本。在马繁殖中，低剂量激素穴位给药已有探索：Alvarenga et al. (1998)报道，于腰骶部Bai-hui穴位给予常规剂量10%的前列腺素F_2α（prostaglandin F_2α, PGF_2α）可有效诱导母马黄体溶解；Ribeiro et al. (2020)于Governing Vessel (GV)-1给予450 IU人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, hCG），约为常规药理剂量的三分之一，结果86.7%母马在治疗后48 h内排卵。Bai-hui已用于母马激素药物穴位注射研究，而Yan-chi等其他穴位传统上被指示用于生殖障碍，但其用于激素药物穴位注射仍研究不足。尽管初步发现提示降低histrelin剂量可能诱导母马排卵，但更低剂量疗效及穴位给药的潜在贡献仍未充分研究；特别是进一步降低histrelin剂量能否维持足够排卵反应，以及于生殖相关穴位给药是否优于相同降低剂量的常规IM给药尚不清楚。研究人员假设降低剂量histrelin可诱导母马48 h内排卵，且Bai-hui或Yan-chi穴位给药是给予这些降低剂量的有效途径。因此，该初步研究旨在评估降低剂量histrelin（75和25 μg）用于母马排卵诱导，并比较常规IM给药与Bai-hui和Yan-chi穴位药物穴位注射。

关键技术方法：该研究为部分随机交叉初步研究，经Pontifícia Universidade Católica do Paraná（PUCPR）动物伦理委员会批准（protocol no. 3456051124）。样本为PUCPR Gralha Azul Experimental Farm教学马群的便利样本。共11匹母马，年龄11–17岁，Henneke评分系统体况评分4–6，有正常繁殖功能史，且无生殖或全身疾病证据。八个方案中每匹母马每发情周期接受一个方案：250 μg histrelin IM（标准剂量，第一周期非随机给予）、75 μg IM、25 μg IM、无干预、1 mL生理盐水Bai-hui、1 mL生理盐水Yan-chi、25 μg histrelin Bai-hui、25 μg histrelin Yan-chi；其余七个方案序列由独立第三方手工抽签简单随机。排卵诱导条件为优势卵泡两轴35–38 mm、子宫水肿评分3、宫颈松弛评分3。IM注射于颈基部；穴位给药由认证兽医针灸师进行，Bai-hui用18 G针，Yan-chi用16 G导管。治疗后18:00给药，24 h后首次经直肠超声检查，随后每日两次10:00和18:00检查，间隔16和8 h，直至检测到排卵。主要结局为48 h内排卵，24 h首次检测到的排卵排除出主要分析。统计分析仅包括完成所有八方案的9匹母马；采用Fisher精确检验与无干预方案进行探索性成对比较，Clopper–Pearson法计算精确95%置信区间（confidence intervals, CIs），Shapiro–Wilk检验评估卵泡直径正态性，重复测量方差分析（analysis of variance, ANOVA）及Tukey多重比较检验比较治疗时卵泡直径，P<0.05为显著，使用GraphPad Prism 10.4.2。

结果与讨论（Results and discussion）：治疗时卵泡直径在方案间无差异（p=0.851）。11匹母马中9匹完成所有八个方案（18%丢失）。两匹在研究期间发生非生殖临床状况，随后停止表现规律卵巢周期，因此未完成交叉研究并被排除出所有分析；一匹最后治疗于2025年2月2日，完成三个方案；另一匹最后治疗于2025年3月5日，完成五个方案。Table 1 Ovulation within 48 h after treatment, by protocol：48 h内排卵见于250 μg histrelin IM后8/9匹（88.9%）、75 μg IM后7/8匹（87.5%）、25 μg IM后7/8匹（87.5%）、25 μg Bai-hui后9/9匹（100%）、25 μg Yan-chi后7/8匹（87.5%）；无干预后3/8匹（37.5%）、Bai-hui生理盐水后3/6匹（50.0%）、Yan-chi生理盐水后1/8匹（12.5%）。精确95% CIs较宽，反映每方案观察数少，且方案间存在大量重叠。与无干预方案的探索性成对比较中，25 μg histrelin Bai-hui与更高比例48 h内排卵相关（p=0.009），其余随机方案与无干预无显著差异（p>0.05）；P值未进行多重比较校正，应谨慎解释。Fig. 1 Examination at which ovulation was detected in each treatment, by protocol：该图展示各方案中首次检测到排卵的检查时点；由于检查间隔为8和16 h，无法确定精确排卵时间。24 h首次检测到的排卵被排除出主要分析，假设其更可能代表治疗时已在进行的自发排卵，但该假设无法验证；敏感性分析将24 h检测到的排卵纳入48 h内排卵未实质性改变结果解释。

讨论总结：在该探索性研究中，histrelin治疗后87.5–100%于48 h内排卵，包括标准剂量的十分之一；无药治疗为12.5–50.0%，与标准剂量报道的82–100%一致。该反应符合药物药理学预期，即垂体释放LH和FSH；25 μg经IM、Yan-chi或Bai-hui给药时均观察到高比例48 h内排卵。Bai-hui数值较高不应解释为优越性证据：这些方案未直接进行统计比较，Bai-hui的置信区间（66.37–100%）与其他histrelin方案重叠，且观察数少限制估计精度。Bai-hui被纳入是因其既往已用于母马激素药物穴位注射研究，Yan-chi主要基于其传统生殖障碍适应症，而支持该穴位激素药物穴位注射的证据仍有限。因此，当前数据未证明在任一穴位给药可增加histrelin的药理效应，这仍是一个假设。该解释与前列腺素研究中Bai-hui较标准IM部位无优势，以及75 μg histrelin在Bai-hui或GV-1与250 μg IM后排卵率相似的报道一致。注射部位、深度和针具特征在方案间不同，可能独立于任何针灸特异性效应而影响药物吸收；需要专门设计用于比较给药部位的研究。无histrelin时排卵率为37.5%、50.0%和12.5%，说明每方案仅6–9次观察带来的变异性。研究采取多项措施减少偏倚：仅纳入生殖道健康且发情周期规律的母马，应用严格排卵诱导标准；8和16 h检查间隔不能确定精确排卵时间，故无法评估方案间排卵时间差异；24 h排卵排除主要分析基于其更可能自发发生的假设；交叉设计使每匹母马接受所有方案，减少个体间变异，但不能排除潜在携带效应。八个方案中七个随机化降低方案与季节进展间系统关联的可能性，但250 μg IM总是首先给予所有母马，因此与治疗顺序和研究时期混杂，应主要作为参考而非完全随机比较。其他局限包括单群小样本、每方案仅评估一个发情周期、统计功效和精度有限；携带效应、季节变异和发情周期生理波动不能完全排除。两匹未完成母马因停止规律卵巢周期，临床记录显示均发生并发非生殖临床状况；周期改变原因未进一步研究，不能建立与并发临床状况或重复histrelin暴露的因果关系。尽管持续释放deslorelin给予后长期暴露于GnRH激动剂与垂体反应降低和发情延迟恢复相关，但本研究的暴露模式显著不同，仍不能排除重复GnRH激动剂给药的贡献。从临床角度，当前发现提供初步证据，表明降低histrelin剂量，包括标准剂量的十分之一，可能足以在母马中48 h内诱导排卵。然而，本研究未证明药物穴位注射较相同降低剂量的常规IM给药具有优势，因此不支持推荐特定给药途径。这些发现需要在更大规模、完全随机、样本量适当计算、更频繁超声监测、激素评估和卵巢周期随访的研究中确认；此类研究还应确定在特定穴位给药是否提供超出降低histrelin剂量本身的额外效应。若进一步研究药物穴位注射，还应考虑操作者经验、注射技术、针具特征和操作者间变异，以建立这些方案的可重复性和临床适用性。研究结论翻译：这些发现提供了初步证据，表明降低的histrelin剂量，包括25 μg，可在母马中于48 h内诱导排卵。然而，本研究未证明药物穴位注射（pharmacopuncture）较相同降低剂量的肌内注射（IM）给药具有优势。需要更大规模、完全随机的研究来确认降低剂量histrelin的疗效，并确定在特定穴位给药是否提供任何额外效应。