《Clinical Rheumatology》：Single-cell eQTL Mendelian randomization reveals the monocyte-associated PRKCB–CTSL axis as a candidate regulatory pathway and potential therapeutic target in rheumatoid arthritis
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目的：类风湿关节炎（RA）涉及持续的免疫失调，但细胞特异性遗传调控通路仍不明确。研究人员整合了细胞特异性遗传与多组学证据，以优先筛选候选调控通路。
方法：将来自17种免疫细胞群体的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs）与RA全基因组关联研究（
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目的：类风湿关节炎（RA）涉及持续的免疫失调，但细胞特异性遗传调控通路仍不明确。研究人员整合了细胞特异性遗传与多组学证据，以优先筛选候选调控通路。
方法：将来自17种免疫细胞群体的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs）与RA全基因组关联研究（GWAS）数据通过两样本孟德尔随机化（MR）进行整合。利用转录组学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和机器学习特征选择识别趋同候选基因。通过单细胞和虚拟扰动分析评估细胞定位和下游变化。分子对接和动力学计算优先筛选化合物，并通过敲低/拯救实验评估PRKCB–CTSL关系。
结果：11个候选基因获得了遗传和转录组学的趋同支持。PRKCB被LASSO、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）三种算法共同保留，并在单核细胞中优先表达。虚拟扰动提示CTSL及抗原加工/呈递通路。PRKCB敲低降低了CTSL表达和核因子κB（NF-κB）磷酸化，而CTSL恢复可部分挽救NF-κB磷酸化。此外，基于结构的分析从所评估的化合物中计算优先筛选出熊去氧胆酸（ursodiol）具有最有利的预测PRKCB相互作用。
结论：遗传、转录组学、单细胞、计算和体外证据支持单核细胞相关PRKCB–CTSL作为RA中的候选调控通路。进一步的机制和体内研究需确立其因果和药理学相关性。
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研究背景与科学问题
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以持续性滑膜炎症、进行性软骨和骨破坏以及系统性免疫失调为特征，最终导致不可逆的关节畸形和多器官损伤。尽管改善病情抗风湿药（DMARDs）和生物制剂显著改善了临床结局，但仍面临治疗反应异质性大、靶点特异性有限以及长期治疗带来的不良反应等挑战。RA的发病机制高度异质，涉及遗传易感性、异常免疫细胞活化、失调的转录程序及炎性信号网络的复杂交互作用。其中，由遗传变异驱动的免疫细胞特异性转录调控被认为是RA发生和发展的关键机制。然而，传统研究多依赖单一组学关联分析，难以区分因果关系与混杂效应，也缺乏对免疫细胞特异性调控网络的系统刻画。因此，亟需通过整合遗传与转录组学证据，系统鉴定因果相关的致病基因，为精准分子分型和靶向治疗策略的开发提供基础。
研究设计与核心发现
为解决上述问题，研究人员建立了一套多层次整合分析框架，将细胞类型特异性遗传证据与独立的多组学和功能验证相结合。具体而言，首先利用来自17种免疫细胞群体的顺式表达数量性状位点（cis-eQTLs）与RA全基因组关联研究（GWAS）数据进行两样本孟德尔随机化（MR）分析，从遗传层面优先筛选RA相关候选基因。随后整合多个公共转录组数据集（GSE55235、GSE55457、GSE77298）进行差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA），通过多组学交集策略鉴定出11个兼具遗传和转录组支持的RA关键靶点。这些靶点的表达谱可将RA分为两种具有不同免疫特征的分子亚型。进一步采用LASSO回归、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）三种机器学习算法联合筛选核心靶点，PRKCB成为唯一被所有算法共同保留的基因。单细胞转录组分析（数据集GSE200815和GSE246416）证实PRKCB在单核细胞中优先表达。通过scTenifoldKnk虚拟基因敲除分析，发现CTSL是PRKCB扰动后变化最显著的下游基因，且富集于抗原加工与呈递通路。分子对接和动力学模拟从DSigDB数据库中筛选出熊去氧胆酸（ursodiol）作为与PRKCB预测结合最强的候选化合物，FAERS数据库安全性评估提供了初步的药理学视角。体外实验在TNF-α刺激的人单核细胞炎症模型中证实，PRKCB敲低可降低CTSL表达并抑制NF-κB磷酸化，而CTSL过表达可部分逆转这一效应，提示PRKCB–CTSL–NF-κB调控轴的存在。
关键技术方法概述
研究人员主要采用了以下关键技术方法：（1）两样本孟德尔随机化（MR），以17种免疫细胞群体的cis-eQTLs为工具变量，RA GWAS汇总统计量为结局；（2）多队列转录组差异表达分析与WGCNA，整合GEO数据库中的GSE55235、GSE55457和GSE77298数据集；（3）LASSO回归、SVM和RF三种机器学习算法联合筛选核心靶点；（4）单细胞转录组分析（Seurat、Harmony批次校正），使用GSE200815和GSE246416数据集；（5）scTenifoldKnk虚拟基因敲除以模拟PRKCB扰动后的转录变化；（6）分子对接（AutoDock Vina）和分子动力学模拟（GROMACS）用于候选药物筛选与验证；（7）Western blot用于体外蛋白水平验证。
研究结果详述
两样本MR分析：从17种免疫细胞群体中鉴定出842个与RA易感性显著相关的细胞特异性eGenes，其中451个为风险基因（OR>1），391个为保护基因（OR<1）。
差异表达分析与WGCNA：整合三个GEO数据集后鉴定出1795个差异表达基因（DEGs），包括1055个上调基因和740个下调基因。WGCNA识别出14个共表达模块，其中MEblue模块与RA状态正相关最强，MEbrown模块负相关最强。
多组学鉴定关键RA相关靶点：通过将MR风险基因与上调DEGs及MEblue模块基因取交集获得10个基因，将MR保护基因与下调DEGs及MEbrown模块基因取交集获得1个基因，共确定11个关键靶点。功能富集分析显示这些靶点主要参与免疫应答负调控、自然杀伤细胞介导的细胞毒性和细胞黏附分子相互作用等通路。
RA分子亚型鉴定：基于11个关键靶点的共识聚类将RA分为C1和C2两个亚型，两者具有不同的免疫浸润特征和通路活性模式，C1亚型呈现更高的活化淋巴细胞浸润。
机器学习识别核心靶点：LASSO、SVM和RF三种算法分别筛选出6、7和2个特征基因，PRKCB是唯一被三者共同识别的基因，被定义为核心RA相关靶点。
PRKCB的免疫浸润与单基因GSEA：PRKCB表达与单核细胞、巨噬细胞、记忆B细胞和髓系来源抑制性细胞（MDSCs）的浸润水平正相关。GSEA显示高PRKCB表达与趋化因子信号、细胞因子受体相互作用等通路正相关。
单细胞转录组分析：在RA滑膜组织中鉴定出8种细胞群体，PRKCB在单核细胞中表达最高。
scTenifoldKnk虚拟敲除：PRKCB虚拟敲除后CTSL为变化最显著的下游基因，差异基因富集于抗原加工与呈递、吞噬体、Th1和Th2细胞分化等通路。
候选药物筛选与分子对接：从DSigDB数据库中筛选出6种FDA批准的候选药物，熊去氧胆酸（ursodiol）与PRKCB的结合能最低（-9 kcal/mol），分子动力学模拟进一步证实复合物构象稳定，MM/PBSA结合自由能为-11.69 kcal/mol。
FAERS安全性评估：2004年至2025年第二季度共纳入6214份有效不良事件报告，不良事件主要涉及全身性疾病、胃肠系统疾病等，男性和高龄是间质性肺病的独立危险因素。
体外实验验证：在TNF-α刺激的单核细胞RA炎症模型中，PRKCB敲低显著降低CTSL蛋白水平和NF-κB磷酸化，而CTSL过表达可部分恢复NF-κB磷酸化，支持PRKCB–CTSL–NF-κB调控轴的假说。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究通过整合细胞类型特异性sc-eQTL、两样本MR、多队列转录组分析、WGCNA、机器学习和单细胞转录组学，优先筛选出11个具有趋同遗传和转录组学证据的RA候选靶点。PRKCB被三种机器学习方法一致优先筛选，并在单核细胞中优先表达。计算扰动提示CTSL和抗原处理相关程序与PRKCB扰动相关，体外PRKCB敲低伴随CTSL表达降低和NF-κB信号减弱。结构分析进一步将熊去氧胆酸确定为与PRKCB具有有利预测相互作用的候选化合物。研究强调，这些发现支持单核细胞相关PRKCB–CTSL关系作为一个可检验的调控假说，而非已确定的线性信号机制。同时指出了多项局限性：缺乏独立外部验证队列；机器学习分析旨在候选优先筛选而非临床预测；体外实验局限于炎症细胞模型，未包含体内关节炎模型；PRKCB采用siRNA而非CRISPR扰动；熊去氧胆酸仅为计算优先筛选，未进行直接结合、靶点参与或药理学验证。研究结论认为，整合细胞类型特异性遗传、转录组学、机器学习、单细胞证据优先筛选出PRKCB作为RA中单核细胞相关候选基因。计算扰动和PRKCB敲低/CTSL拯救支持潜在的PRKCB–CTSL–NF-κB调控关系，结构分析确定了熊去氧胆酸为计算优先筛选的化合物。这些发现为进一步的机制研究提供了基础，但在确立PRKCB或熊去氧胆酸的治疗相关性之前，仍需独立的验证、靶点参与、药理学和体内研究。
